CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7. Phương pháp bố trí thực nghiệm
2.2.7.1. Cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu
Luận án tiếp cận các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ mô tả ở hình 2.5.
Hình 2.5. Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu của luận án Rong nâu
Nghiên cứu sàng lọc loài rong nâu dùng cho sản xuất fucoidan và alginate
Xác định thời điểm thu hoạch rong nâu Lựa chọn loài rong nâu
cho nghiên cứu Chiết fucoidan theo
quy trình của Viện NC
& ƯDCN Nha Trang
Nghiên cứu chế độ nấu chiết sodium alginate Xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa dịch chiết
Đánh giá chất lượng sodium alginate Đề xuất quy trình tách
chiết sodium alginate Thủy phân sodium
alginate bằng phương pháp hóa học
Thu nhận alginate khối lượng phân tử
thấp (KLPTT)
Xác định hàm lượng các alginate KLPTT Đánh giá chất lượng các
alginate KLPTT
Nghiên cứu điều chế sodium guluronate
sulfate (SGS)
Xác định điều kiện phản ứng điều chế tác nhân
sulfate hóa Xác định điều kiện phản
ứng tổng hợp SGS Tách chiết sodium
alginate
Đề xuất quy trình sản xuất SGS và đánh giá các đặc
tính của SGS
Đánh giá hoạt tính chống đông máu và
độc tính của SGS Đánh giá độc tính của SGS Đánh giá hoạt tính chống
đông máu của SGS
* Thời gian thu mẫu: từ tháng 1/2013 ÷ 7/2013
* Hàm lượng fucoidan và sodium alginate cao nhất
* pH (8÷12), nhiệt độ (50oC
÷ 80oC), thời gian (1÷4 giờ)
* Hàm lượng và độ nhớt của sodium alginate đạt đồng thời lớn nhất
* Nồng độ ethanol (50 ÷ 80%)
* Hàm lượng sodium alginate cao nhất
* Nhiệt độ (30oC÷90oC);
thời gian (15÷120 phút), tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2
(3/1÷4,75/1 mol/g)
* DS của SGS lớn nhất
* Thời gian (1÷6 giờ), Nhiệt độ (30oC÷50oC); và tỷ lệ nồng độ NaNO2/SG (1/198
÷3,5/198 mol/g), pH (3÷11)
* DS của SGS lớn nhất
* Khối lượng phân tử trung bình (15÷35kDa);
* Nồng độ (25÷75μg/mL)
* Liều cao (2 mg/ngày), liều vừa (1 mg/ngày), liều thấp (0,5 mg/ngày).
* Quan sát lâm sàng; khối lượng; xét nghiệm nước tiểu;
xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu; giải phẩu và quan sát vi thể.
Ba loài rong nâu thuộc hai chi (2 loài thuộc chi Sargassum và 1 loài thuộc chi Turbinaria) thu mẫu tại 3 địa điểm ở vịnh Nha Trang được nghiên cứu sàng lọc nhằm đánh giá hàm lượng tích lũy fucoidan và alginate theo thời gian sinh trưởng và phát triển của rong nâu, từ đó xác định được thời gian thu hoạch rong thích hợp dùng cho sản xuất fucoidan và alginate. Để sàng lọc loài rong nâu, luận án tiến hành thu mẫu theo từng loài riêng biệt, thời gian thu mẫu rong từ ngày 10 đến ngày 15 trong tháng từ tháng 1/2013 đến tháng 7/2013. Trên cơ sở đánh giá hàm lượng alginate có trong rong nâu sau khi rong đã được tách chiết fucoidan, luận án sẽ lựa chọn được loài rong để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Sau khi lựa chọn được đối tượng rong nâu dùng cho nghiên cứu, tiến hành tách chiết fucoidan theo quy trình [27] như sau: rong được cắt nhỏ (0,5 ÷ 1 cm), ngâm rong với hỗn hợp dung dịch (ethanol 96%/Chloroform/H2O = 89/1/10) theo tỉ lệ 1/10 (w/v) trong thời gian 10 ÷ 15 ngày. Sau đó tách dịch chiết và rong được chiết 3 lần bằng dung dịch HCl 0,1N (pH 2 ÷ 2,5), tỷ lệ rong/dung dịch là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết 60oC trong 2 giờ với mỗi lần chiết. Dịch chiết fucoidan được lọc tách thô qua vải lọc. Rong được rửa qua 3 lần bằng nước sạch đến pH trung tính (khoảng 6,5) để dùng cho tách chiết sodium alginate.
Luận án tiến hành tối ưu hóa để xác định được các thông số phù hợp cho quá trình nấu chiết sodium alginate từ rong nâu nhằm đáp ứng đồng thời hai mục tiêu thu được sodium alginate có hàm lượng và độ nhớt cao nhất. Bên cạnh đó, luận án nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol dùng để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết, từ đó xác định được nồng độ ethanol thích hợp. Từ các kết quả nghiên cứu, luận án đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu và đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate thu được.
Sodium alginate thu được ở trên, được sử dụng để điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp. Trên cơ sở kết quả tổng quan tài liệu nghiên cứu về các phương pháp thủy phân sodium alginate để thu được sodium alginate khối lượng phân tử thấp cho thấy phương pháp thủy phân hóa học (dùng acid) được sử dụng khá phổ biến trên thế giới. Tuy nhiên, phương pháp thủy phân từng phần alginate của tác giả Chandía và cộng sự (2001) được thực hiện trên cơ sở cải biến phương pháp thủy phân alginate bằng acid của các tác giả Haug và cộng sự (1963), Haug và cộng sự (1974), đặc biệt đây là phương pháp phù hợp với điều kiện để tiến hành nghiên cứu. Do vậy, luận án ứng dụng phương pháp thủy phân sodium alginate bằng acid của tác giả Chandía và cộng sự (2001) để thu nhận các alginate khối lượng phân tử thấp. Luận án nghiên cứu xác định hàm lượng và đánh giá chất lượng của các sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu được
từ quá trình thủy phân sodium alginate bằng acid.
Phân đoạn sodium guluronate khối lượng phân tử thấp được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính chống đông máu. Theo kết quả tổng quan tài liệu nghiên cứu cho thấy bản thân sodium guluronate khối lượng phân tử thấp không có hoạt tính chống đông máu.
Tuy nhiên, khi sodium guluronate được sulfate hóa thì có hoạt tính này. Từ đó, luận án nghiên cứu điều chế sodium guluronate sulfate. Quá trình điều chế sodium guluronate sulfate tiến hành theo phương pháp của Dapeng Cui và cộng sự (2007) [56] và Lihong Fan và cộng sự (2011) [74] qua hai bước: đầu tiên là điều chế tác nhân sulfate hóa, sau đó tiến hành phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate. Trên cơ sở khảo sát các điều kiện phản ứng để xác định điều kiện thích hợp điều chế sodium guluronate sulfate. Đánh giá các đặc tính của sodium guluronate sulfate, khảo sát hoạt tính chống đông máu và đánh giá độc tính của nó là cơ sở khoa học cho ứng dụng alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng phòng chống đông máu.
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, luận án đề xuất quy trình sản xuất alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.
2.2.7.2. Sàng lọc một số loài rong dùng cho sản xuất fucoidan và sodium alginate Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định thời điểm thu hoạch thích hợp đối với các loài rong nâu dùng làm nguyên liệu cho sản xuất fucoidan và alginate.
Tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu
Ba loài rong nâu thuộc hai chi (2 loài thuộc chi Sargassum (S. polycystum và S.
mcclurei) và 1 loài thuộc chi Turbinaria (T. ornata)) được thu mẫu theo từng loài riêng biệt tại 3 địa điểm ở vịnh Nha Trang. Thời gian thu mẫu rong từ ngày 10 đến ngày 15
Rong nâu
Đánh giá hàm lượng fucoidan và alginate theo thời gian
Tháng 1
Xác định thời điểm thu hoạch rong nâu và lựa chọn loài rong
nghiên cứu
Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7
từ tháng 1/2013 đến tháng 7/2013. Tiến hành đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate (từ rong nâu sau khi rong đã được chiết fucoidan), từ đó xác định được thời gian thu hoạch rong thích hợp cho sản xuất fucoidan và alginate. Đồng thời lựa chọn được loài rong nâu để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.7.3. Tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate từ rong nâu
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định được điều kiện tối ưu của công đoạn nấu chiết rong đáp ứng đồng thời cả hai mục tiêu thu được hàm lượng và độ nhớt của alginate cao nhất.
Sau khi xác định được loài rong nâu làm đối tượng nghiên cứu, luận án tiến hành tách chiết fucoidan theo quy trình của Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Rong (sau khi tách fucoidan) được thu hồi để tách chiết sodium alginate. Rong được nấu chiết với dung dịch kiềm với tỷ lệ rong/ dung dịch kiềm là 1/25 (w/v).
Trong quá trình nấu chiết có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sodium alginate thu được. Trong phạm vi nghiên cứu, luận án chỉ khảo sát 3 yếu tố ảnh hưởng chính: nồng độ pH của dung dịch kiềm, nhiệt độ và thời gian nấu chiết.
Phương pháp tối ưu hóa: để khảo sát các giá trị tối ưu, áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp I với 3 yếu tố và 2 hàm mục tiêu theo sơ đồ mô tả như hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ đồ tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate Các biến đầu vào: - Z1: pH (nồng độ dung dịch kiềm): 8 ÷ 12 - Z2: Nhiệt độ nấu chiết: 50oC ÷ 80oC - Z3: Thời gian nấu chiết: 1 giờ ÷ 4 giờ
Hàm mục tiêu: - Y1: Hàm lượng sodium alginate (%w/w), Y1 Y1max
- Y2 : Độ nhớt của sodium alginate (cP), Y2 Y2max Các yếu tố ảnh hưởng n = 3 và số thí nghiệm N = 2k + 3 = 11.
Phương trình hồi quy có dạng: Y = b0 + b1x + b2x + b3x + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3
Các hàm mục tiêu được lựa chọn trong quá trình tối ưu hóa là hàm hàm lượng sodium alginate (Y1) và hàm độ nhớt của sodium alginate (Y2), đây là các chỉ tiêu quan
Công đoạn nấu chiết Z1
Z2
Z3 Y2
Y1
trọng ảnh hưởng đến chất lượng cũng như ảnh hưởng lớn đến chi phí sản xuất.
Thực tế không thể có một nghiệm chung cho cả hai quá trình để đạt được Y1 và Y2 gần Y1max, Y2max. Để tìm được nghiệm thỏa mãn, sử dụng phương pháp chập tuyến tính:
YL = α1Y1 + α2Y2
Trong đó - α1: hệ số quan trọng ứng với hàm mục tiêu hàm lượng (Y1) - α2: hệ số quan trọng ứng với hàm mục tiêu độ nhớt (Y2).
Mục đích thu nhận sodium alginate có chất lượng cao nên ưu tiên cho hàm mục tiêu là độ nhớt, chọn α1 = 0,4 và α2 = 0,6 (vì độ nhớt là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến chất lượng sodium alginate, còn hàm lượng ảnh hưởng nhiều đến chi phí sản xuất).
Hàm đa mục tiêu: YL = 0,4Y1 + 0,6Y2
2.2.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định nồng độ ethanol thích hợp để gây kết tủa alginate có trong dịch chiết rong nâu. Tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ hình 2.8
Hình 2.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate Sau khi tìm được các thông số thích hợp cho công đoạn nấu chiết, luận án tiến hành nấu chiết sodium alginate từ rong nâu với các tham số tối ưu. Dịch chiết sodium alginate thu được điều chỉnh về pH = 1,8 bằng dung dịch HCl 10%. Kết tủa acid alginic được hình thành và tách ra bằng phương pháp lọc. Dung dịch Na2CO3 10% được cho vào acid alginic đến pH = 7,0 ÷ 7,5 rồi để trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng, có khuấy đảo.
Tiến hành thẩm tích đối nước 72 giờ, cô đặc và kết tủa sodium alginate bằng ethanol với các nồng độ từ 50 ÷ 80%. Lọc thu kết tủa rồi sấy chân không ở 50oC trong 4 giờ thu
Rong nâu Nấu chiết
Dịch chiết sodium alginate
Xác định hàm lượng sodium alginate 65%
50% 55% 60% 70% 75% 80%
Xác định nồng độ ethanol thích hợp Kết tủa ethanol
được sodium alginate. Dựa trên khối lượng sodium alginate thu được để xác định nồng độ ethanol thích hợp.
2.2.7.5. Điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm thu được alginate khối lượng phân tử thấp có các thông số cụ thể về khối lượng phân tử, đặc tính cấu trúc, độ tinh sạch, ... dùng làm vật liệu để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống đông máu. Sodium alginate khối lượng phân tử thấp được điều chế bằng phương pháp thủy phân acid theo phương pháp của Chandía và cộng sự (2001) [49] được mô tả ở hình 2.9.
Hình 2.9. Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp
Dựa trên việc xác định khối lượng của các phân đoạn alginate để đánh giá hàm lượng của các phân đoạn alginate khối lượng phân tử thấp thu được từ quá trình thủy phân alginate bằng acid. Đánh giá một số chỉ tiêu về chất lượng của các alginate khối
Ly tâm Phần tan
Sodium alginate
Đun hồi lưu HCl 0,3M, 100oC, 30 phút Ly tâm
Phần không tan Phần tan
Đun hồi lưu HCl 0,3M, 100oC, 2 giờ
Trung hòa Điều chỉnh pH = 2,85±0,05
Phần không tan Phần tan
Trung hòa Thẩm tách
SMG
Phần không tan
Ly tâm
Trung hòa Thẩm tách
Cô đặc Cô đặc
Kết tủa Kết tủa
Ly tâm Trung hòa
Thẩm tách Cô đặc
Ly tâm
Ly tâm
Sấy Sấy
SM SG
Sấy Kết tủa
lượng phân tử thấp (đặc biệt là sodium guluronate khối lượng phân tử thấp) dùng làm vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo của luận án.
2.2.7.6. Khảo sát các điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định được các điều kiện thích hợp của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa – tác nhân chủ yếu tham gia quá trình điều chế alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu.
Điều chế tác nhân sulfate hóa (trisulfonate sodium amine (N(SO3Na)3)) được tiến hành theo phương pháp của Dapeng Cui và cộng sự (2007) [56] và Lihong Fan và cộng sự (2011) [74]. Sử dụng NaHSO3 và NaNO2 để điều chế tác nhân sulfate hóa, không sử dụng các tác nhân như H2SO4, HCl, H2S, SO2 vì chúng gây thủy phân mạch polymer.
Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa theo hình 2.10
Hình 2.10. Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa
Điều chế tác nhân sulfate hóa thực hiện trong bình cầu ba cổ đáy tròn kèm với ống sinh hàn và thiết bị khuấy từ. Một lượng NaHSO3 đã chuẩn bị trước được cho vào bình cầu, 40 mL nước cất khử ion được cho vào bình phản ứng. Sau đó nâng nhiệt độ phản ứng lên 50oC. Một lượng NaNO2 đã chuẩn bị hòa trong 2 mL nước cất khử ion được nhỏ từ từ từng giọt vào bình phản ứng kèm theo khuấy từ.
Ảnh hưởng của các điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa được xác định dựa trên độ thay thế của sodium guluronate sulfate. Do vậy, để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa, thì quá trình khảo sát được tiến hành với các điều kiện của quá trình tổng hợp SGS cố định như sau: pH = 7, tỷ lệ nồng độ giữa tác nhân sulfate hóa/ sodium guluronate là 1/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng 50oC và thời gian phản ứng 3 giờ.
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa trong khoảng nhiệt độ từ 30 ÷ 90oC. Thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là 60 phút và tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2 là 4/1 mol/g. Dựa trên độ thay thế của
4NaHSO3 + NaNO2 = NaO3S – N + Na2SO3 + 2H2O SO3Na
SO3Na
SGS để xác định nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa thích hợp. Tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ hình 2.11 như sau:
Hình 2.11. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
b. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
Sau khi đã xác định được nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa ở trên, luận án tiến hành phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa từ 15 ÷ 120 phút, tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2 là 4/1 mol/g. Dựa trên độ thay thế của SGS để xác định thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa thích hợp. Tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ hình 2.12 như sau:
Hình 2.12. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
Xác định độ thay thế của SGS
70oC 80oC 90oC 30oC 40oC 50oC 60oC
NaHSO3 NaNO2
Phản ứng
Xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp
Xác định độ thay thế của SGS
75ph 90ph 105ph
15ph 30ph 45ph 60ph
NaHSO3 NaNO2
Phản ứng
Xác định thời gian phản ứng thích hợp
120ph
c. Ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
Sau khi đã xác định được nhiệt độ và thời gian thích hợp cho phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa, luận án tiến hành phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 từ 3/1 ÷ 4,75/1 mol/g. Dựa trên độ thay thế của SGS để xác định tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 điều chế tác nhân sulfate hóa thích hợp.
Tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ hình 2.13.
Hình 2.13. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS
2.2.7.7. Khảo sát các điều kiện tổng hợp sodium guluronate sulfate
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình điều chế alginate khối lượng phân tử thấp (sodium guluronate sulfate – SGS) để nghiên cứu hoạt tính chống đông máu và đánh giá độc tính của nó trên chuột thí nghiệm.
Quá trình tổng hợp SGS xảy ra theo phản ứng ở hình 2.14
Hình 2.14. Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate
SG SGS
NaHSO3 NaNO2
Tỷ lệ NaHSO3/ NaNO2
4/1 4,25/1 4,5/1 4,75/1
3/1 3,25/1 3,5/1 3,75/1
Phản ứng
Xác định độ thay thế của SGS Xác định tỷ lệ NaHSO3/ NaNO2 thích hợp