L ỜI CÁM ƠN
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1. Phương phỏp phõn tớch hoỏ học
1) Kiểm tra dư lượng kim loại nặng (Pb, Cd, Hg) theo phương phỏp AAS, tiờu chuẩn tham chiếu theo NMKL No.139,1991 (đối với chỉ tiờu Pb và Cd), tham chiếu theo AOAC No.974.14,1995 (đối với chỉ tiờu Hg). (Phụ lục 2)
* Phương phỏp đo phổ nguyờn tử hấp thụ (AAS - Absorption Spectrophotometric):
Nguyờn tắc của phương phỏp: cỏc nguyờn tử ở trạng thỏi bỡnh thường thỡ chỳng khụng hấp thu hay bức xạ năng lượng nhưng khi chỳng ở trạng thỏi tự do dưới dạng những đỏm hơi nguyờn tử thỡ chỳng hấp thu và bức xạ năng lượng. Mỗi nguyờn tử chỉ hấp thu những bức xạ nhất định tưng ứng với những bức xạ mà chỳng cú thể phỏt ra trong quỏ trỡnh phỏt xạ của chỳng. Khi nguyờn tử nhận năng lượng chỳng chuyển lờn mức năng lượng cao hơn gọi là trạng thỏi kớch thớch. Quỏ trỡnh đú gọi là quỏ trỡnh hấp thu năng lượng của
nguyờn tử tự do ở trạng thỏi hơi và tạo ra phổ của nguyờn tử đú. Phổ sinh ra trong quỏ trỡnh này gọi là phổ hấp thu nguyờn tử. Nguyờn tắc làm việc: Khi đốn làm việc, catot được nung đỏ, giữa catot và anot xảy ra sự phúng điện liờn tục. Do sự phúng điện đú mà một số phõn tử khớ bị ion húa. Cỏc ion vừa được sinh ra sẽ tấn cụng vào catot làm bề mặt catot núng đỏ và một số nguyờn tử kim loại trờn bề mặt catot bị húa hơi và nú trở thành những nguyờn tử kim loại tự do. Khi đú dưới tỏc dụng của nhiệt độ trong đốn HCl đang được đốt núng đỏ, cỏc nguyờn tử kim loại này bị kớch thớch và phỏt ra phổ phỏt xạ của nú. Đú chớnh là phổ vạch của chớnh kim loại làm catot rỗng. Nhưng vỡ trong điều kiện làm việc đặc biệt của mụi trường khớ trơ cú ỏp suất thấp, nờn phổ phỏt xạ đú chỉ bao gồm cỏc vạch nhạy của kim loại đú.
2) Độc tố gõy tiờu chảy (DSP): phương phỏp sinh học trờn chuột, Độc tố gõy liệt cơ (PSP), Độc tố gõy mất trớ nhớ (ASP): HPLC. (Phụ lục 4)
* Phương phỏp phõn tớch cỏc chất bằng sắc ký lỏng hiệu cao năng
(HPLC - High - performance liquid chromatography)
Nguyờn tắc của phương phỏp: phương phỏp phõn tớch dựa trờn nguyờn tắc húa lý (hấp thụ và nhả hấp thụ liờn tục chất chất hấp thụ) và dựa vào sự hỗ trợ của cỏc thiết bị trờn nguyờn tắc quang điện để phỏt hiện ra nồng độ của chất phõn tớch. Cú thể núi một cỏch đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph) đi kốm với một detector nhạy để cú thể phỏt hiện được cỏc chất tỏch ra trong quỏ trỡnh chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đĩ chuyển sắc ký cột thành phương phỏp phõn tớch cú tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải cú hệ thống bơm cao ỏp để đẩy pha động vớI ỏp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dũng chảy với lưu lương vài mililit/phỳt. Lượng mẩu phõn tớch bằng HPLC chỉ cần khoảng 20l. Điều khỏc biệt giữa HPLC và GC là trong phương phỏp HPLC, mẫu chỉ cần làm hồ tan mà khụng cần làm bay hơi, do đú HPLC cú thể phõn tớch được cỏc chất mà khụng sợ gõy ra sự phõn hủy do nhiệt độ trong quỏ trỡnh phõn tớch. Cỏc dạng sắc ký lỏng hiệu cao năng:
- Dạng trao đổi ion: pha tĩnh là cỏc chất hữu cơ mang cỏc nhúm hoạt động khỏc nhau: cation để tỏch cỏc kim loại kiềm và kiềm thổ, amonium, cỏc amin-anion để tỏch cỏc ion vụ cơ, phosphate hưu cơ.
- Dạng HPLC phõn bố: sử dụng cỏc pha tĩnh và pha động cú độ phõn cực khỏc nhau. Nếu pha tĩnh khụng phõn cực trong khi pha động phõn cực thỡ được gọi là dạng sắc ký đảo pha (reverse phase chromatography). Dạng này cú thể tỏch được cỏc thành phần khụng phõn cực như cỏc hydrocarbon cú phõn tử khối lớn hơn 1000, cỏc vitamin tan trong dầu,anthraquinon, … Dạng sắc ký pha thuận cú thể tỏch cỏc hợp chất cú alcol, cỏc amin, … Mỏy HPLC gồm cú cỏc bộ phận chớnh như sau: Hệ thống cung cấp dung mụi và bơm cao ỏp, hệ thống đưa mẫu vào cột, cột sắc ký, detector, hệ thống ghi nhận kết quả. Trong đú hệ thống cung cấp dung mụi và bơm cao ỏp: Dung mụi của pha độn được bơm cao ỏp hỳt đẩy pha động vào cột vớI ỏp suất khoảng 300atm, lưu lượng dướI 4,0ml/phỳt. Lưu lượng và ỏp lực bơm cú ảnh hưởng lớn vào mủi sắc ký. Cú thể sử dụng một trong hai loạ bơm: Bơm đảy hoạc bơm thuỷ lực. Hệ thống đưa mẫu vào cột: Mẩu được bơm vào cột qua một màng cao su đặc biệt cú khả năng giữ ỏp suất trong hệ thống cố định.Lượng mẫu được đưa vào cột vớI thể tớch nhỏ, khỏng 10-50l bằng ống tiờm hay hệ thống nạp mẫu tự động. Cột sắc ký là cột nhồi chất rắn mang thường được chế tạo bằng hợp kim chịu được ỏp suất cao đến 5000psi và cú tốc độ chỏy cở ml/phỳt. Cỏc loại cột thụng dụng:
Bảng 2.2. Cỏc loại cột thụng dụng của phương phỏp HPLC
Loại cột Đường kớng
ống Chiều dài Tốc độ chạy
Cột quy ước Cột phõn tớch nhanh cột cú đường kớnh nhỏ 4,0-4,6mm 4,0-4,6mm 1,0-2,0mm 15-30cm 4-13cm 15-100cm 1-2 ml/phỳt 2-4 ml/phỳt 0,03-1 ml/phỳt
Trong đú cột cú đường kớnh 4.6mm được dựng nhiều nhất chiếm 44,5%; cột đường kớnh 4,0mm là 16.7%. Cột phõn tớch nhanh cú thời gian phõn tớch rất ngắn, dễ thay đổi tốc độ chảy từ cột quy ước sang cột phõn tớch nhanh.tuy nhiờn cú nhũng bất tiện là phảI trang bị thể tớch cột phụ rất thấp, thể tớch cuvett của detector phảI nhỏ, việc nhận và sử lý tin hiệu phải nhanh. Cộ cú đường kớnh nhỏ tiết kiệm dung mụi pha động.
2.3.2. Xỏc định cỏc vi sinh vật gõy bệnh cú trong nguyờn liệu nghờu (phụ lục 3) lục 3)
Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khớ (TPC): phương phỏp thử định lượng, tiờu chuẩn tham chiếu theo NMKL 86:1999.
- Kiểm tra tổng số Fecal coliform (MNP/100g): phương phỏp thử định lượng, tiờu chuẩn tham chiếu theo NMKL 44:1995.
- Kiểm tra Samonella: phương phỏp thử định tớnh, tiờu chuẩn tham chiếu theo TCVN 5287:1994.
- Kiểm tra Vibrio cholera: phương phỏp thử định tớnh, tiờu chuẩn tham chiếu theo FDA-1995.
- Kiểm tra Vibrio parahaemolyticus: phương phỏp thử định lượng, tiờu chuẩn tham chiếu theo FDA-1995.
2.4. Thiết bị và hoỏ chất sử dụng trong luận văn. 2.4.1. Hoỏ chất. 2.4.1. Hoỏ chất.
Aceton, ethanol, toluidine blue, NaCl, Reorcinol-acetal, sunfuaric aicd, phenol, hydroxyt kali, K2SO4 và một số chất chuẩn. Hầu hết cỏc hoỏ chất sử dụng trong luận văn đều dựng của hĩng Merck (Đức) và Trung Quốc.
2.4.2.Thiết bị sử dụng chủ yếu.
Cõn điện tử loại 220g độ chớnh xỏc 10-4 gam, mỏy so màu, mỏy HPLC, mỏy AAS.
2.5. Phương phỏp xử lý số liệu.
Xử lý số liệu nghiờn cứu và vẽ biểu đồ phõn tớch bằng excel (mỗi thớ nghiệm làm 3 lần, mỗi lần kiểm tra 3 mẫu. Kết quả là trung bỡnh cộng của cỏc lần thớ nghiệm).
2.6 Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm
2.6.1. Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm tổng quỏt
Thu maĩu
Bảo quản mẫu
Đỏnh giỏ cỏc kết quả phõn tớch
Xử lý mẫu, phõn tớch cỏc chỉ tiờu
2.6.2. Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm kiểm tra vi sinh vật
4 tuần
Phõn tớch cỏc chỉ tiờu vi sinh
Đỏnh giỏ kết quả
Thụng bỏo, khuyến cỏo thờiđiểm thu hoạch Đề xuất giải phỏp khi cú mối nguy xuất hiện 6tuần 8 tuần 10 tuần 12 tuần 14 tuần
Cụ thể hoỏ chương trỡnh kiểm soỏt
16 tuần
2 tuần
Tiếp cận tại vựng nuụi
Thu mẫu theo thời gian sinh
2.6.3. Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm kiểm tra độc tố sinh học
4 tuần
Phõn tớch cỏc chỉ tiờu độc tố
Đỏnh giỏ kết quả
Thụng bỏo, khuyến cỏo thờiđiểm thu hoạch Đề xuất giải phỏp khi cú mối nguy xuất hiện 6tuần 8 tuần 10 tuần 12 tuần 14 tuần Cụ thể hoỏ chương trỡnh kiểm soỏt 16 tuần 2 tuần Tiếp cận tại vựng nuụi
Thu mẫu theo thời gian sinh
2.6.4. Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm kiểm tra kim loại nặng
Thụng bỏo, khuyến cỏo thờiđiểm thu hoạch Đề xuất giải phỏp khi cú mối nguy xuất hiện Cụ thể hoỏ chương trỡnh kiểm soỏt Phõn tớch cỏc chỉ tiờu kim loại nặng Đỏnh giỏ kết quả 4 tuần 12 tuần 16 tuần 1 tuần Tiếp cận tại vựng nuụi
Thu mẫu theo thời gian
CHƯƠNG 03
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU CHỈ TIấU VI SINH VẬT
3.1.1. Biến đổi của vi sinh vật Fecal coliform theo thời gian nuụi.
Sau khi thu mẫu tại bĩi bồi, tiến hành xử lý và bảo quản mẫu. Kết quả phõn tớch số lượng vi sinh vật Fecal coliform theo thời gian nuụi được trỡnh bày tại bảng 3.1 phụ lục 01 và biểu diễn như hỡnh 3.1.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thời gian L ư ợ n g v i si n h v ậ t (M N P /1 0 0 g )
Hỡnh 3.1. Biến đổi của vi sinh vật Fecal coliform theo thời gian nuụi. Nhận xột và thảo luận.
Vi sinh vật Fecal coliform cú nguồn gốc từ phõn, nước bẩn, rỏc, trong qỳa trỡnh nuụi Fecal coliform rất dễ lõy nhiễm vào nguyờn liệu nghờu.
Từ kết quả phõn tớch cho ta thấy sự biến đổi về số lượng vi sinh vật Fecal coliform từ 15/8 phỏt triển tăng và đạt đỉnh vào 30/9 (1300 MPN/100g) sau đú lại giảm cực tiểu ở 15/10 (430 MPN/100g) rồi tăng cực đại tại giữa thỏng 11 (15/11) (2800 MPN/100g) sau đú giảm đến cuối quỏ trỡnh nghiờn cứu 1/12. Trong quỏ trỡnh nuụi mụi trường nuụi ngày càng nhiễm bẩn, số
lượng vi sinh vật Fecal coliform ngày càng tăng nờn số lượng Fecal coliform trong nghờu cũng tăng lờn nhưng phỏt triển đến một mức cao nờn dinh dưỡng trong mụi trường ngày càng ớt nờn số lượng vi sinh vật Fecal coliform ngày càng giảm theo thời gian nuụi.
Thời điểm cuối thỏng 10 số lượng Fecal coliform bị giảm mạnh do thời tiết khụng thuận lợi mưa nhiều, nhiệt độ giảm nờn khụng thuận lợi cho sự phỏt triển của Fecal coliform.
Sau thỏng 10, mụi trường nuụi ngày càng nhiễm bẩn, số lượng vi sinh vật Fecal coliform ngày càng tăng nờn số lượng Fecal coliform trong nghờu cũng tăng lờn nhưng phỏt triển đến một mức cao nờn dinh dưỡng trong mụi trường ngày càng ớt nờn số lượng vi sinh vật Fecal coliform ngày càng giảm theo thời gian nuụi.
Nhỡn chung, thỡ số lượng Fecal coliform vẫn nằm trong giới hạn cho phộp so với tiờu chuẩn đụi với nguyờn liệu nghờu thương phẩm của EU.
3.1.2. Biến đổi của vi sinh vật tổng số hiếu khớ (TPC) theo thời gian nuụi.
Sau khi thu mẫu tại bĩi bồi, tiến hành xử lý và bảo quản mẫu. Kết quả phõn tớch số lượng vi sinh vật TPC theo thời gian nuụi được trỡnh bày tại bảng 3.2 phụ lục 01 và biểu diễn như hỡnh 3.2 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hỡnh 3.2. Biến đổi của tổng vi sinh vật hiếu khớ theo thời gian nuụi.
7/8 15/8 30/8 15/9 30/9 15/10 30/10 15/11 1/12 L ư ợ ng vi s inh vậ t (C fu/ g) 10 5
Nhận xột và thảo luận.
Vi sinh vật hiếu khớ là vi sinh vật chỉ tồn tại trong điều kiện cú oxy tự do. Chỳng được xỏc định bằng cỏch đếm khuẩn lạc mọc được trờn mụi trường thạch trypton glucoza ủ ở 300 trong 72 giờ. Sau 24 giờ đếm sơ bộ khuẩn lạc và sau 72 giờ đếm chớnh thức để tớnh kết quả.
Từ hỡnh 3.2 cho thấy, sau khi nuụi nghờu, khảo sỏt theo thời gian số lượng vi sinh vật tổng số hiếu khớ tăng nhanh. Tuy nhiờn, sự dao động trong cỏc lần phõn tớch khụng cao, trong khoảng thời gian khảo sỏt từ 7/8 đến 1/12/2008 thỡ số lượng vi sinh vật tổng số hiếu khớ tăng từ 5,2x105 đến 9,6x105 Cfu/g.
Sự tăng trưởng của vi sinh vật tổng số hiếu khớ phụ thuộc vào một số yếu tố:
- Thời gian nuụi nghờu. - Lồi vi sinh vật.
- Điều kiện mụi trường: nhiệt độ, ỏnh sỏng, pH, ... - Thành phần mụi trường dinh dưỡng.
Số lượng vi sinh vật tổng số hiếu khớ tăng trong quỏ trỡnh sinh trưởng của nghờu do cú nhiều điều kiện thuận lợi: nhiệt độ mụi trường thớch hợp với sự sinh trưởng và phỏt triển (từ thỏng 8 đến thỏng 12 vựng nuụi được nghiờn cứu cú nhiệt độ dao động từ 240C đến 380C), mụi trường nuụi ngày càng giàu chất dinh dưỡng cú lợi cho vi sinh vật phỏt triển do quỏ trỡnh trao đổi chất với mụi trường bờn ngồi của nghờu ngày càng tăng, chất thải của nghờu vào mụi trường nuụi tăng làm mụi trường nuụi ngày càng ụ nhiễm.
3.1.3. Biến đổi của vi sinh vật Salmonella theo thời gian nuụi.
Sau khi thu mẫu tại bĩi bồi, tiến hành xử lý và bảo quản mẫu. Kết quả phõn tớch số lượng vi sinh vật Salmonella, theo thời gian nuụi được trỡnh bày tại bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả phõn tớch vi sinh vật Salmonella theo thời gian nuụi
Thời điểm thu mẫu Vi sinh vật
15/8 30/8 15/9 30/9 15/10 30/10 15/11 1/12
Salmonella/25g Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ghi chỳ: Pos (Positive): Dương tớnh; (Negative): Âm tớnh
Nhận xột và thảo luận
Từ bảng 3.1 cho thấy, đối với mẫu phõn tớch chỉ tiờu vi sinh vật
Salmonella theo thời gian nuụi từ thỏng 8 đến thỏng 11 đều cú kết quả õm tớnh. Tuy nhiờn, trong thỏng 12 cú sự xuất hiện chỉ tiờu vi sinh vật Salmonella
dương tớnh (Pos).
Theo thời tiết tại Cà Mau, thường vào đầu mựa mưa và cuối mựa khụ (thỏng 06 và thỏng 12) Salmonella thường xuất hiện trong mụi trường nước nuụi trồng thủy sản [35]. Do đú, thời gian thu mẫu nghờu ở thỏng 12 cú sự xuất hiện Salmonella dương tớnh.
3.1.4. Biến đổi của vi sinh vật Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus theo thời gian nuụi. theo thời gian nuụi.
Sau khi thu mẫu tại bĩi bồi, tiến hành xử lý và bảo quản mẫu. Kết quả phõn tớch số lượng vi sinh vật Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus theo
thời gian nuụi được trỡnh bày tại bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả phõn tớch vi sinh vật Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus theo thời gian nuụi
Thời điểm thu mẫu Vi sinh vật
15/8 30/8 15/9 30/9 15/10 30/10 15/11 1/12
Vibrio cholerae/25g Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Vibrio parahaemolyticus/25g Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Từ bảng 3.2 khụng tỡm thấy Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus
trong tất cả cỏc mẫu đĩ phõn tớch.
Nhỡn chung, cỏc chỉ tiờu Salmonella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, thỡ khả năng bắt gặp trong mẫu nghờu là rất thấp. Vỡ vậy, trong nghờu nguyờn liệu thương phẩm đạt tiờu chuẩn nguyờn liệu thủy sản
tươi sống, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo cỏc tiờu chuẩn Việt Nam và quốc tế (EU).
3.1.5. Phõn loại vi sinh sơ bộ vựng thu hoạch.
Việc phõn loại vi sinh vựng thu hoạch dựa trờn kết quả lấy mẫu phõn tớch cỏc chỉ tiờu vi sinh vật trong thịt nhuyễn thể. Kết quả phõn tớch dựng để phõn loại vi sinh vựng thu hoạch nghờu dựa theo chỉ thị 853 EC/2004 như bảng 3.3
Bảng 3.3. Phõn loại vựng nguyờn liệu nghờu theo tiờu chuẩn vi sinh
Phõn loại Yờu cầu
Vựng loại A
Dưới 300 Fecal coliform trong 100g thịt nhuyễn thể và dịch ngoại bào theo phộp thử MPN với 5 ống 3 đậm độ trong ớt nhất 90% số mẫu kiểm.
Salmonella õm tớnh trong 25 g thịt nhuyễn thể và dịch ngoại bào
Vựng loại B
Từ 300 đến dưới 6.000 Fecal coliform trong 100g thịt nhuyễn thể trong 90% số mẫu thử theo phộp thử MPN với 5 ống 3 độ đậm trong ớt nhất 90% số mẫu kiểm
Vựng loại C
Từ 6000 đến dưới 60.000 Fecal coliform trong 100g thịt nhuyễn thể theo phộp thử MPN với 5 ống 3 độ đậm trong ớt nhất 90% số mẫu kiểm
Vựng loại D
Từ 60.000 Fecal coliform trở lờn trong 100g thịt nhuyễn thể theo phộp thử MPN với 5 ống 3 độ đậm trong ớt nhất 90% số mẫu kiểm
Từ bảng phõn loại và kết qủa phõn tớch cỏc vi sinh vật như ở bảng 3.3 nờu trờn, vựng nuụi nghờu Sụng Đốc,Trần Văn Thời được khảo sỏt xếp loại B.