Thí nghiệm định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

 Ý nghĩa

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí được quy định theo TCVN 5165-90. Quy trình định lượng TSVKHK được thể hiện ở hình 2.4.

Mẫu

Chợ PTN

Đánh giá cảm quan

Đối chiếu với tiêu chuẩn Kết luận Trạng thái Mùi vị Màu sắc

Hình 2.4: Quy trình tóm tắt định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 2.2.4.4. Thí nghiệmđịnh lượng Coliforms và fecal coliforms

 Ý nghĩa:

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Sự hiện diện của coliforms

dùng làm vi sinh vật chỉ thị chất lượng vệ sinh của nước hay vi sinh vật chỉ thị thông thường của điều kiện vệ sinh trong quá trình chế biến thực phẩm. Fecal coliforms là vi sinh vật chỉ thị mức độ ô nhiễm từ nguồn phân. Phương pháp định lượng coliforms và fecal coliforms được quy định theo TCVN 4882: 2007. Quy trình định lương coliforms và fecal coliforms được thể hiện ở hình 2.5.

Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu+225ml dung dịch nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3

Chọn 3 nồng độ pha loãng phù hợp lên tiếp nhau.

Chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội 45 – 500C. Lắc cho mẫu phân tán đều trong môi trường

Ủ ở 350C / 24 - 48 giờ

Chọn những đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Hình 2.5: Quy trình tóm tắt định lượng Coliforms, fecal coliforms

2.2.4.5. Thí nghiệm định lượng Staphylococcus aureus

 Ý nghĩa:

Sự hiện diện với mật độ cao ( > 102) của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. Phương pháp định

Tra bảng Mac Crandy, xác định tổng số Coliforms

có trong mẫu(MPN/g) Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu+225ml dung dịch

nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3

Chuyển 1ml mẫu vào ống chứa 5ml LSB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại)

Ủ ở 350C / 24 giờ

Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy ống dương tính lên canh EC. Ủ ở 450C/24h

Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi )

Tra bảng Mac Crandy để tính tổng số Fecalcoliform có trong mẫu (MPN/g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

lượng S.aureus theo TCVN 4830 -1:2005. Quy trình định lượng S.aureus được thể

hiện trên hình 2.6.

Hình 2.6: Quy trình tóm tắt định lượng Staphylococcus aureus

Cấy 1ml mẫu vào ống chứa 5ml GCB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại).

Ủ ở 370C / 24 giờ

Chọn những ống đục (+)cấy ria trên môi trường thạch BP

Ủ ở 370C / 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện test sinh hóa

Đếm số ống dương tính với thử nghiệm Coagulase sau 4h quan sát. Hoặc ghi nhận số đĩa có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch muối Manitol sau 24h nuôi ủ ở 350C

Tính toán số lượng S. aureus (MPN/g) Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3

Chuẩn bị mẫu: 25g mẫu+225ml nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu

Test sinh hóa: thử nghiệm Coagulase hoặc cấy ria trên môi trường thạch muối Manitol

2.2.4.6. Bố trí thí nghiệm kiểm tra định tính Salmonella:

 ý nghĩa:

Salmonella là vi khuẩn gây bệnh đường ruột rất nguy hiểm cho người và động

vật máu nóng. Khi xảy ra vụ dịch thường lây lan rất nhanh và khó kiểm soát.Vì vậy, cơ quan y tế ra quyết định cứ 25 g thực phẩm có mặt Salmonella thì thực phẩm đó không được sử dụng và phải tiêu hủy. Phương pháp định tính Salmonella được quy định theo TCVN 4829:2005. Quy trình định tính Salmonella được thể hiện trên hình 2.7

Hình 2.7: Quy trình định tính Salmonella

Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu/225ml BPW. Đồng nhất mẫu

Ủ tăng sinh ở 350C/ 24h

Cấy tăng sinh 0,1ml mẫu vào ống chứa 10ml RV (Ủ ở 420C/24h)

Cấy ria sang môi trường XLD ( Ủ ở 350C/24h)

Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Thực hiện các test sinh hóa: thử nghiệm glucose (KIA), thử nghiệm H2S (KIA), thử nghiệm indol, thử nghiệm Voges - Proskauer, thử nghiệm Methyl Red

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý thống kê (Descriptive Statistic, Anova – Single factor, T–test, Duncan test) với mức ý nghĩa α = 0,05 và vẽ đồ thị trên phần mềm Excel 2007.

2.2.6. Hóa chất, dụng cụ và thiết bi sử dụng trong đề tài 2.2.6.1. Các loại môi trường và hóa chất 2.2.6.1. Các loại môi trường và hóa chất

 Dung dịch nước muối sinh lý:

Đây là môi trường dùng để pha loãng VSV trong quá trình định lượng. Tiến hành pha chế trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan và phân phối vào mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm:

NaCl 8,5g Nước cất: 1000ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Plate Count Agar (PCA)

Đây là môi trường thạch dùng để định lượng tổng sinh vật hiếu khí, tiến hành pha trong chai, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đó lắc đều. Thành phần gồm: Peptone 5,0g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 14g Nước cất 1000ml

 Trypton Soya Agar (TSA)

Đây là môi trường thạch không chọn lọc được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, trước khi hấp khử trùng phải đun để tan hết agar. Thành phần gồm:

Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g

NaCl 5g

Agar 15g Nước cất 1000ml

 Baird Parker Agar (BPA)

Đây là môi trường dùng để phân lập Staphylococcus aureus. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp xong thì giữ ấm ở 450C rồi

bổ sung thêm EY (Egg yorlk tellurite), trộn đều tránh tạo bọt khí, đổ đĩa, phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm:

Tryptone 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 1g Sodium pyruvate 10g Glycine 10g Lithium chloride.6H2O 5g Agar 15g Egg yorlk tellurite 50ml Nước cất 1000ml

 Manitol Salt Agar (thạch muối manitol)

Đây là môi trường dùng để chẩn đoán sơ bộ sự có mặt của S.aureus. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm:

Casein pancreatic 5g Peptone 5g Cao thịt 5g NaCl 75g D – Manitol 10g Phenol red 25mg Agar 15g Nước cất 1000ml  Buffered Peptone Water (BPW)

Đây là môi trường tiền tăng sinh Salmonella, được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g Nước cất 1000ml

 Rappaport Vassiliadis Soy Peptone (RV)

Đây là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc Salmonella, được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 4,5g MgCl2.6H2O 28,6g NaCl 7,2g K2HPO4 0,18g KH2PO4 1,26g Malachite green oxalate 0,036g Nước cất 1000ml

 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

Đây là môi trường thạch dùng để phân lập Salmonella, môi trường này không được hấp khử trùng, do đó phải đong trước một thể tích xác định nước cất vào bình, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó, cân môi trường khô vào bình, đun tan đổ đĩa, tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g NaCl 5g D(+)xylose 3,5g Lactose 7,5g Sucrose 7,5g L(+)lysine 5,0g Sodium desoxycholate 2,5g Sodium thiosulphate 6,8g Ammonium iron citrate 0,8g Phenol red 0,08g Agar 13,5g Nước cất 1000ml  Lauryl Sulphate Broth (LSB):

Đây là môi trường lỏng dùng trong định lượng coliforms. Môi trường pha trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm rồi cho ống Durham úp ngược vào, đậy nút bông, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Tryptose 2g Lactose 5g Sodium chloride 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sulphate 0,1g Nước cất 1000ml  EC

Đây là môi trường lỏng dùng trong định lượng fecalcoliforms (cách pha giống với môi trường LSB). Thành phần gồm:

Tryticase hoặc tryptose 20g Muối mật 1,5g Lactose 5g

KH2PO4 1,5g K2HPO4 4,5g Nước cất 1000ml

 Giolitti cantoni broth (GCB)

Đây là môi trường lỏng dùng để tăng sinh Staphylococcus aureus. Môi

trường được pha trong cốc thủy tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, đậy nút bông, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.Thành phần gồm: Peptone casein 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Lithium chloride 5g D(-)Manitol 20g Sodium chloride 5g Glycine 1,2g Sodium pyruvate 3g Nước cất 1000ml

 Kligler Iron Agar (KIA)

Đây là môi trường thạch nghiêng sâu, được pha vào trong cốc thủy tinh, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 1210C trong 15 phút. Sau đó lắc đều và làm nghiêng ống sao cho sau khi môi trường đông đặc phải có phần sâu khoảng 2cm. Thành phần gồm: Peptone 20g Lactose 10g Dextrose 10g NaCl 5g Feric ammonium 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1000ml

 Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP)

Môi trường này được sử dụng để thử phản ứng Methyl red và Voges- Proskauer. Đây là môi trường lỏng, được pha vào trong cốc khuấy tan, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Peptone 5g K2HPO4 5g Glucose 5g Nước cất 1000ml  Thuốc thử  Methyl red  Kovac’s

 α- napthol 5%  Dung dịch KOH 40%  xylene 2.2.6.2. Dụng cụ, thiết bị:  Đĩa petri  Pipet 1ml, 2ml, 5ml…  Ống nghiệm các loại  Bình tam giác các loại  Cốc thủy tinh các loại  Tủ ấm 370C, 450C  Tủ sấy dụng cụ  Nồi thanh trùng  Tủ lạnh  Cân điện tử  Phòng cấy vô trùng  Bếp điện  Que cấy  Đèn cồn

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh chung của đậu phụ tại các chợ

Kết quả khảo sát một số thông tin liên quan đến các quầy bán đậu phụ tại 4 chợ trên địa bàn thành phố Nha Trang như sau:

- Đậu phụ là sản phẩm dễ chế biến, dễ tiêu thụ nên phần lớn chủ quầy hàng cũng chính là người trực tiếp chế biến ra sản phẩm. Chỉ có một số ít các chủ quầy bán đậu phụ là mua lại và bán kèm với các mặt hàng khác như rau, củ, quả…

- Các quầy đậu phụ tập trung chủ yếu bên phía ngoài chợ, phía trong chợ số lượng quầy ít hơn.

- Thời gian bắt đầu bán hàng: thường dao động từ 5h30 đến 6h30.

3.1.1. Số lượng quầy bán

Kết quả khảo sát về số lượng các quầy bán đậu phụ tại 4 chợ trong thời gian từ ngày 2/4 đến ngày 15/6 được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Số lượng quầy bán đậu phụ tại một số chợ trên địa bàn thành phố Nha Trang Thông tin Chợ Tổng số quầy đậu phụ Số quầy sử dụng tác nhân nước chua tự nhiên

Số quầy sử dụng tác nhân ion Phước Hải 6 3 3 Xóm Mới 16 11 5 Chợ Đầm 17 12 5 Vĩnh Thọ 4 0 4 Nhận xét:

Kết quả khảo sát số lượng quầy đậu phụ sử dụng tác nhân kết tủa khác nhau tại các chợ cho thấy, số lượng quầy bán đậu phụ dùng tác nhân nước chua tự nhiên nhiều hơn số quầy bán đậu phụ dùng tác nhân ion. Có thể giải thích là do truyền

thống sử dụng nước chua tự nhiên lâu năm của các chủ quầy, họ không thích thay đổi tác nhân kết tủa để giữ nguyên chất lượng sản phẩm.

- Phần lớn các quầy bán đậu phụ tập trung phía ngoài nhiều hơn phía trong chợ vì tiếp cận với khách hàng dễ dàng và cũng thuận tiện cho khách hàng.

3.1.2. Vị trí quầy hàng, dụng cụ chứa đựng, cách bảo quản, ý thức về vệ sinh của người bán hàng: của người bán hàng:

3.1.2.1.Vị trí và độ cao của các quầy đậu

Đa số quầy hàng đậu phụ tập trung phía bên ngoài chợ, nằm gần đường lộ và đặt ở vị trí thấp (quầy hàng cao chưa tới 1m) nên càng làm cho bụi, nước bẩn dễ vấy vào sản phẩm.

Những quầy hàng phía trong chợ được sắp xếp cao hơn và thông thoáng hơn. Dù các quầy có đặt phía trong hay phía ngoài chợ cũng không tránh khỏi việc sắp xếp xen kẽ với các quầy hàng thực phẩm khác như các quầy thịt, cá, gia cầm, rau củ, hoa quả.

Qua đó có thể thấy rằng điều kiện bày bán không có sự bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, đặc biệt, nhiều quầy đặt ngay cạnh các quầy thực phẩm khác như rau củ, hoa quả, thịt, cá, làm tăng nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật từ quầy này sang quầy khác.

Hình 3.1: Hình ảnh quầy đậu phụ đặt cạnh quầy rau quả và quầy thịt (chợ Xóm Mới)

Hình 3.2: Hình ảnh một quầy đậu phụ đặt cạnh đường lộ sát với quầy bán thịt và trứng gia cầm (chợ Xóm Mới)

Hình 3.3: Hình ảnh một quầy đậu phụ đặt gần quầy cá (chợ Phước Hải) 3.1.2.2. Dụng cụ chứa đựng

Để chứa đựng, người sản xuất cũng như người bán hàng thường dùng các dụng cụ thô sơ như: thùng sơn tái sử dụng; thùng nhựa; khay gỗ; khay nhựa, mâm nhôm để chứa đựng và bày bán sản phẩm. Những dụng cụ này nếu không được người bán làm vệ sinh sạch sẽ thường xuyên dễ tạo ra chỗ trú ẩn cho vi sinh vật đặc biệt là tại các góc khay, góc thùng, đây cũng là nguyên nhân dẫn đến việc không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

3.1.2.3. Cách bảo quản sản phẩm của người bán

Trong quá trình bán hàng người bán thường cho đậu vào khay rồi đậy lại bằng tấm vải xô, tấm bao nilon hoặc dùng cách ngâm đậu vào thùng nước và đậy lại. Tuy nhiên có những trường hợp hoàn toàn không che chắn khay chứa đậu trong suốt quá trình bán hàng.

Dễ dàng thấy cách bảo quản của người bán chỉ giúp tránh được những nguy cơ xâm nhập từ bên ngoài vào như bụi, nước bẩn, côn trùng và nhiễm chéo từ các quầy hàng khác nhưng không tránh được nguy cơ xâm nhiễm từ bên trong. Nguy cơ bên trong có thể kể đến như việc sử dụng tấm nilon, tấm vải xô không sạch sẽ hoặc ẩm ướt để che đậy khay đậu, nước ngâm đậu không đạt tiêu chuẩn và không được thay trong suốt thời gian bán hàng chính là điều kiện tốt cho vi sinh vật phát triển, nhất là các loài ưa ấm.

3.1.2.4. Ý thức của người bán hàng

Đa số người bán hàng không được trang bị kiến thức về an toàn vệ sinh thực phẩm, vì vậy họ thường có các thói quen như: không đeo găng tay và khẩu trang khi buôn bán; dùng tay không để trao đổi tiền và sản phẩm với khách; dùng tay không tiếp xúc với nhiều bề mặt khác rồi lại chạm vào các miếng đậu phụ.

Việc không ý thức giữ gìn vệ sinh đôi bàn tay trong suốt quá trình bán hàng làm tăng nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật từ nhiều nguồn khác nhau. Ngoài ra việc không sử dụng khẩu trang cũng làm tăng nguy cơ gây lây nhiễm vi sinh vật có nguồn gốc từ người vào đậu phụ do việc hắt hơi và nói chuyện tự do của người bán hàng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Hình 3.4: Thói quen dùng tay không trao đổi tiền và sản phẩm với khách hàng của một chủ quầy đậu phụ tại chợ Phước Hải.

Theo kết quả của quá trình khảo sát, đánh giá ban đầu về vệ sinh an toàn thực phẩm (xét về mặt vi sinh), sản phẩm đậu phụ được bày bán tại các chợ không đảm bảo về tính an toàn, là sản phẩm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cao nếu không biết cách xử lý trước khi ăn. Do cách suy nghĩ thông thường của một số người tiêu dùng xem đậu phụ là thực phẩm đã được làm chín nên khi mua sản phẩm từ chợ về sử dụng họ chỉ xử lý rất sơ sài như chỉ rửa qua với nước hoặc chần sơ qua với nước sôi. Thói quen ăn sống đậu phụ mà không xử lý nhiệt chính là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật gây bệnh.

3.2. Kết quả đánh giá cảm quan các mẫu đậu

Chỉ tiêu cảm quan là một trong những chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm. Chỉ tiêu cảm quan có tác động lớn đến sự lựa chọn của người tiêu dùng vì thông qua chỉ tiêu cảm quan có thể đánh giá được mức độ tươi ngon hoặc hư hỏng của sản phẩm.

Khi tiến hành phân tích, tiến hành song song việc phân tích mẫu thu tại chợ và mẫu thu tại phòng thí nghiệm nhằm đánh giá và so sánh với tiêu chuẩn (theo danh