Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 14 mẫu đậu phụ lấy từ 4 điểm chợ khác nhau, tại nhiều quầy hàng khác nhau trong cùng khu chợ và 6 lô sản xuất vào các ngày khác nhau tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang.
Hình 2.1 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
- Thu thập thông tin. - Quan sát. Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh Tại PTN Thu mẫu Tại các chợ Mẫu đậu phụ sử dụng tác nhân ion Mẫu đậu sử dụng tác nhân nước chua tự nhiên Mẫu đậu phụ sử dụng nước chua kháng khuẩn Phân tích vi sinh: -TSVKHK - Coliforms - Fecal coliforms - S. aureus - Salmonella Đánh giá cảm quan: - Trạng thái - Màu sắc - Mùi vị Kết quả vi sinh Kết quả cảm quan Đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật của đậu phụ tại các chợ So sánh mức độ nhiễm vi sinh vật giữa 2 nhóm mẫu tại các chợ So sánh mức độ nhiễm giữa mẫu đậu phụ tại chợ và tại PTN
2.2.2. Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát tình hình chung về vệ sinh an toàn của đậu phụ tại các chợ trên địa bàn thành phố Nha Trang từ đó đưa ra nhận xét chung về mức độ an toàn của sản phẩm.
Phân tích các chỉ tiêu vi sinh và cảm quan từ đó đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật của đậu phụ tại các chợ trên địa bàn thành phố Nha Trang.
So sánh mức độ nhiễm vi sinh vật giữa mẫu đậu phụ sử dụng tác nhân đông tụ nước chua tự nhiên và mẫu sử dụng tác nhân ion của các chợ.
So sánh mức độ nhiễm vi sinh vật giữa mẫu đậu phụ sử dụng nước chua tự nhiên tại các chợ và mẫu sử dụng nước chua lên men lactic có tính kháng khuẩn tại
phòng thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp thu mẫu, chuẩn bị mẫu và phân tích 2.2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu
Thu mẫu:
Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và khi mang về phòng thí nghiệm phải phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích.
Tại chợ : Sau khi khảo sát đúng thông tin của mỗi quầy đậu trong các chợ bắt đầu thu mẫu. Trong mỗi chợ chọn ngẫu nhiên 2 quầy sử dụng tác nhân kết tủa nước chua tự nhiên và 2 quầy sử dụng tác nhân kết tủa là các ion (ngoại trừ chợ Vĩnh Thọ chỉ có 4 quầy và đều sử dụng tác nhân kết tủa là các ion, nên chỉ chọn ngẫu nhiên 2 quầy).
Điều kiện để chọn 2 quầy sử dụng tác nhân đông tụ giống nhau trong cùng 1 chợ: khoảng cách giữa 2 quầy cách phải đặt xa nhau, có thể chọn 2 quầy có đặc diểm khác nhau như độ cao của quầy, vị trí quầy… tùy theo chợ (danh sách các quầy hàng được chọn thể hiện trong mục 5, phụ lục 1).
Mẫu sau khi mua cho vào nilon sạch vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (không quá 1giờ đồng hồ từ lúc lấy mẫu đến lúc vận chuyển về phòng thí nghiệm).
Các mẫu sau khi lấy phải tách riêng lẻ để bảo đảm không có sự nhiễm lẫn nhau giữa các mẫu.
Mẫu sản xuất tại PTN: chọn 6 lô được sản xuất vào các ngày khác nhau (ngày 30/3, ngày 9/4, ngày 15/4, ngày 23/4, ngày 7/5, ngày 2/6).
Bảo quản mẫu:
Sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì mẫu được bảo quản ở -18oC .
Chuẩn bị mẫu:
Nếu mẫu mang về được phân tích ngay thì tiến hành nhanh việc cân mẫu và đồng nhất mẫu.
Nếu mẫu đã qua bảo quản đông thì cần thực hiện việc rã đông mẫu theo nguyên tắc sau:
Rã đông trước khi phân tích: Rã đông phải đảm bảo mẫu vẫn không bị nhiễm, không đổi bao đựng cho mẫu. Rã đông thông thường từ 2-5oC trong 18 giờ tuy nhiên thời gian không cho phép nên thường áp dụng biện pháp rã đông ở 45oC trong 15 phút. Khi rã đông ở nhiệt độ cao phải lắc đều mẫu nhằm rút ngắn thời gian rã đông và làm nhiệt độ mẫu đồng đều.
Cân mẫu: Mẫu lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm (lấy 4 góc và 1 điểm trung tâm của khuôn đậu). Các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần đảm bảo vô trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích. Trong đề tài này khối khối lượng mẫu cân là 25g.
Đồng nhất mẫu khi phân tích: sự phân phối của vi sinh vật không đồng đều nhau, để đảm bảo tính đồng nhất trong mẫu, mẫu đậu phụ (thuộc dạng bán rắn) phải được nghiền nhuyễn .
2.2.3.2. Phương pháp phân tích
- Đánh giá cảm quan các mẫu đậu phụ theo các chỉ tiêu: trạng thái, màu sắc, mùi vị và đối chiếu với tiêu chuẩn.
- Phân tích các chỉ tiêu vi sinh :
Xác định số lượng coliforms và fecal coliforms bằng phương pháp MPN. Xác định số lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN. Kiểm tra sự có mặt của Salmonnella bằng phương pháp định tính..
2.2.4. Bố trí thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4.1. Thí nghiệm khảo sát tình hình VSATTP của các quầy đậu phụ
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tình hình VSATTP của các quầy đậu phụ
Tác nhân kết tụ sử
dụng
Chợ
Phước Hải Xóm mới Chợ Đầm Vĩnh Thọ
Thu thập thông tin từ người bán hàng Quan sát các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu vi sinh Thời gian bắt đầu bày bán Vị trí, độ cao quầy Dụng cụ chứa đựng Cách thức bảo quản Ý thức vệ sinh của người bán Nhận xét tình hình về vệ sinh an toàn của đậu phụ tại các chợ
2.2.4.2. Thí nghiệm đánh giá chỉ tiêu cảm quan
Hình 2.3 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá cảm quan
2.2.4.3. Thí nghiệm định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
Ý nghĩa
Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí được quy định theo TCVN 5165-90. Quy trình định lượng TSVKHK được thể hiện ở hình 2.4.
Mẫu
Chợ PTN
Đánh giá cảm quan
Đối chiếu với tiêu chuẩn Kết luận Trạng thái Mùi vị Màu sắc
Hình 2.4: Quy trình tóm tắt định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 2.2.4.4. Thí nghiệmđịnh lượng Coliforms và fecal coliforms
Ý nghĩa:
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Sự hiện diện của coliforms
dùng làm vi sinh vật chỉ thị chất lượng vệ sinh của nước hay vi sinh vật chỉ thị thông thường của điều kiện vệ sinh trong quá trình chế biến thực phẩm. Fecal coliforms là vi sinh vật chỉ thị mức độ ô nhiễm từ nguồn phân. Phương pháp định lượng coliforms và fecal coliforms được quy định theo TCVN 4882: 2007. Quy trình định lương coliforms và fecal coliforms được thể hiện ở hình 2.5.
Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu+225ml dung dịch nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Chọn 3 nồng độ pha loãng phù hợp lên tiếp nhau.
Chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Rót vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội 45 – 500C. Lắc cho mẫu phân tán đều trong môi trường
Ủ ở 350C / 24 - 48 giờ
Chọn những đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm
Hình 2.5: Quy trình tóm tắt định lượng Coliforms, fecal coliforms
2.2.4.5. Thí nghiệm định lượng Staphylococcus aureus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ý nghĩa:
Sự hiện diện với mật độ cao ( > 102) của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. Phương pháp định
Tra bảng Mac Crandy, xác định tổng số Coliforms
có trong mẫu(MPN/g) Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu+225ml dung dịch
nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 1ml mẫu vào ống chứa 5ml LSB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại)
Ủ ở 350C / 24 giờ
Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy ống dương tính lên canh EC. Ủ ở 450C/24h
Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi )
Tra bảng Mac Crandy để tính tổng số Fecalcoliform có trong mẫu (MPN/g)
lượng S.aureus theo TCVN 4830 -1:2005. Quy trình định lượng S.aureus được thể
hiện trên hình 2.6.
Hình 2.6: Quy trình tóm tắt định lượng Staphylococcus aureus
Cấy 1ml mẫu vào ống chứa 5ml GCB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại).
Ủ ở 370C / 24 giờ
Chọn những ống đục (+)cấy ria trên môi trường thạch BP
Ủ ở 370C / 24 giờ
Chọn khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện test sinh hóa
Đếm số ống dương tính với thử nghiệm Coagulase sau 4h quan sát. Hoặc ghi nhận số đĩa có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch muối Manitol sau 24h nuôi ủ ở 350C
Tính toán số lượng S. aureus (MPN/g) Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Chuẩn bị mẫu: 25g mẫu+225ml nước muối sinh lý. Đồng nhất mẫu
Test sinh hóa: thử nghiệm Coagulase hoặc cấy ria trên môi trường thạch muối Manitol
2.2.4.6. Bố trí thí nghiệm kiểm tra định tính Salmonella:
ý nghĩa:
Salmonella là vi khuẩn gây bệnh đường ruột rất nguy hiểm cho người và động
vật máu nóng. Khi xảy ra vụ dịch thường lây lan rất nhanh và khó kiểm soát.Vì vậy, cơ quan y tế ra quyết định cứ 25 g thực phẩm có mặt Salmonella thì thực phẩm đó không được sử dụng và phải tiêu hủy. Phương pháp định tính Salmonella được quy định theo TCVN 4829:2005. Quy trình định tính Salmonella được thể hiện trên hình 2.7
Hình 2.7: Quy trình định tính Salmonella (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị mẫu: cân 25g mẫu/225ml BPW. Đồng nhất mẫu
Ủ tăng sinh ở 350C/ 24h
Cấy tăng sinh 0,1ml mẫu vào ống chứa 10ml RV (Ủ ở 420C/24h)
Cấy ria sang môi trường XLD ( Ủ ở 350C/24h)
Chọn khuẩn lạc đặc trưng
Thực hiện các test sinh hóa: thử nghiệm glucose (KIA), thử nghiệm H2S (KIA), thử nghiệm indol, thử nghiệm Voges - Proskauer, thử nghiệm Methyl Red
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê (Descriptive Statistic, Anova – Single factor, T–test, Duncan test) với mức ý nghĩa α = 0,05 và vẽ đồ thị trên phần mềm Excel 2007.
2.2.6. Hóa chất, dụng cụ và thiết bi sử dụng trong đề tài 2.2.6.1. Các loại môi trường và hóa chất 2.2.6.1. Các loại môi trường và hóa chất
Dung dịch nước muối sinh lý:
Đây là môi trường dùng để pha loãng VSV trong quá trình định lượng. Tiến hành pha chế trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan và phân phối vào mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm:
NaCl 8,5g Nước cất: 1000ml
Plate Count Agar (PCA)
Đây là môi trường thạch dùng để định lượng tổng sinh vật hiếu khí, tiến hành pha trong chai, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đó lắc đều. Thành phần gồm: Peptone 5,0g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 14g Nước cất 1000ml
Trypton Soya Agar (TSA)
Đây là môi trường thạch không chọn lọc được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, trước khi hấp khử trùng phải đun để tan hết agar. Thành phần gồm:
Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g
NaCl 5g
Agar 15g Nước cất 1000ml
Baird Parker Agar (BPA)
Đây là môi trường dùng để phân lập Staphylococcus aureus. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp xong thì giữ ấm ở 450C rồi
bổ sung thêm EY (Egg yorlk tellurite), trộn đều tránh tạo bọt khí, đổ đĩa, phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm:
Tryptone 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 1g Sodium pyruvate 10g Glycine 10g Lithium chloride.6H2O 5g Agar 15g Egg yorlk tellurite 50ml Nước cất 1000ml
Manitol Salt Agar (thạch muối manitol)
Đây là môi trường dùng để chẩn đoán sơ bộ sự có mặt của S.aureus. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm:
Casein pancreatic 5g Peptone 5g Cao thịt 5g NaCl 75g D – Manitol 10g Phenol red 25mg Agar 15g Nước cất 1000ml Buffered Peptone Water (BPW)
Đây là môi trường tiền tăng sinh Salmonella, được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g Nước cất 1000ml
Rappaport Vassiliadis Soy Peptone (RV)
Đây là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc Salmonella, được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 4,5g MgCl2.6H2O 28,6g NaCl 7,2g K2HPO4 0,18g KH2PO4 1,26g Malachite green oxalate 0,036g Nước cất 1000ml
Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đây là môi trường thạch dùng để phân lập Salmonella, môi trường này không được hấp khử trùng, do đó phải đong trước một thể tích xác định nước cất vào bình, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó, cân môi trường khô vào bình, đun tan đổ đĩa, tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g NaCl 5g D(+)xylose 3,5g Lactose 7,5g Sucrose 7,5g L(+)lysine 5,0g Sodium desoxycholate 2,5g Sodium thiosulphate 6,8g Ammonium iron citrate 0,8g Phenol red 0,08g Agar 13,5g Nước cất 1000ml Lauryl Sulphate Broth (LSB):
Đây là môi trường lỏng dùng trong định lượng coliforms. Môi trường pha trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm rồi cho ống Durham úp ngược vào, đậy nút bông, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm: Tryptose 2g Lactose 5g Sodium chloride 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sulphate 0,1g Nước cất 1000ml EC
Đây là môi trường lỏng dùng trong định lượng fecalcoliforms (cách pha giống với môi trường LSB). Thành phần gồm:
Tryticase hoặc tryptose 20g Muối mật 1,5g Lactose 5g
KH2PO4 1,5g K2HPO4 4,5g Nước cất 1000ml
Giolitti cantoni broth (GCB)
Đây là môi trường lỏng dùng để tăng sinh Staphylococcus aureus. Môi
trường được pha trong cốc thủy tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, đậy nút bông, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.Thành phần gồm: Peptone casein 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Lithium chloride 5g D(-)Manitol 20g Sodium chloride 5g Glycine 1,2g Sodium pyruvate 3g Nước cất 1000ml
Kligler Iron Agar (KIA)
Đây là môi trường thạch nghiêng sâu, được pha vào trong cốc thủy tinh, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 1210C trong 15 phút. Sau đó lắc đều và làm nghiêng ống sao cho sau khi môi trường đông đặc phải có phần sâu khoảng 2cm. Thành phần gồm: Peptone 20g Lactose 10g Dextrose 10g NaCl 5g Feric ammonium 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1000ml
Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP)
Môi trường này được sử dụng để thử phản ứng Methyl red và Voges- Proskauer. Đây là môi trường lỏng, được pha vào trong cốc khuấy tan, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 1210C trong 15 phút. Thành phần gồm:
Peptone 5g K2HPO4 5g Glucose 5g Nước cất 1000ml Thuốc thử Methyl red Kovac’s
α- napthol 5% Dung dịch KOH 40% xylene 2.2.6.2. Dụng cụ, thiết bị: Đĩa petri Pipet 1ml, 2ml, 5ml… Ống nghiệm các loại Bình tam giác các loại Cốc thủy tinh các loại Tủ ấm 370C, 450C Tủ sấy dụng cụ Nồi thanh trùng Tủ lạnh Cân điện tử Phòng cấy vô trùng Bếp điện Que cấy Đèn cồn
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh chung của đậu phụ tại các chợ
Kết quả khảo sát một số thông tin liên quan đến các quầy bán đậu phụ tại 4 chợ trên địa bàn thành phố Nha Trang như sau:
- Đậu phụ là sản phẩm dễ chế biến, dễ tiêu thụ nên phần lớn chủ quầy hàng cũng chính là người trực tiếp chế biến ra sản phẩm. Chỉ có một số ít các chủ quầy bán đậu phụ là mua lại và bán kèm với các mặt hàng khác như rau, củ, quả…
- Các quầy đậu phụ tập trung chủ yếu bên phía ngoài chợ, phía trong chợ số lượng quầy ít hơn.
- Thời gian bắt đầu bán hàng: thường dao động từ 5h30 đến 6h30.
3.1.1. Số lượng quầy bán
Kết quả khảo sát về số lượng các quầy bán đậu phụ tại 4 chợ trong thời gian