CHƯƠNG 3: KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG KẸO CỨNG THEO CÁC CHỈ
3.3. Xác định tổng số nấm men nấm mốc
Môi trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn ( chất khoáng sinh như Oxytetracyclin hoặc Chloramphenicol ).
Cấy lên bề mặt thạch của môi trường Yeast Glucose Chloramphenicol một lượng mẫu đã được pha loãng nhất định và nuôi ở nhiệt độ 30 ± 10C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48 đến 72 giờ. Đếm tấc cả số khuẩn lạc mọc trên đó, từ đó suy ra lượng nấm men – nấm mốc có trong mẫu phân tích.
3.3.2. Chuẩn bị dụng cụ hóa chất
- Dụng cụ chuẩn bị mẫu ( thìa, cối xay, dao kéo, pince…)
- Tủ sấy, đèn cồn - Hộp petri
- Nồi hấp - Pipet 1, 2, 5, 10ml
- Tủ ấm - Bình tam giác 100ml
- Cân kỹ thuật - Cốc thủy tinh 50, 250ml
- Cồn 700 - Ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm - Máy và bút đếm khuẩn lạc
3.3.3. Chuẩn bị môi trường
3.3.3.1. Môi trường YGC ( Yeast Glucose Chlorampheniclo )
- Cao nấm men : 5g - Glucose : 20g
- Agar : 15g - Chlorampheniclo : 0,1g - H2O cất : 1000ml - ( Tetracyclin, Oxy tetracylin) Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 phút.
3.3.3.2. Dung dịch pha loãng
Nước pepton 1%, nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng.
Tất cả dụng cụ đã được khử trùng truowcs khi tiến hành thử nghiệm. Môi
trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sang trước khi sử dụng. môi trường thạch SDA còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng.
3.3.4. Chuẩn bị mẫu phân tích
Đối với chỉ tiêu này ta dùng dung dịch mẫu nước đường chưa đem đi đun sôi để tiến hành pha loãng và làm mẫu thử.
Ta pha loãng nước đường theo tỉ lệ 1/100, 1/1000, 1/100000 theo cách pha loãng bình thường. Pha loãng thập phân tích trong dung dịch nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng. Thời gian thao tác không quá 30 phút.
Rửa sạch và khử trùng dụng cụ ( hộp petri, pipet, ống nghiệm, dụng cụ chứa mẫu ) và các dung dịch pha loãng.
3.3.5. Gieo cấy mẫu lên môi trường dinh dưỡng
- Cấy mẫu: có hai cách tùy theo từng loại môi trường sử dụng.
- Lấy 1m l mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri ( mỗi độ pha loãng nên làm đồng thời 2 – 3 hộp và nên làm ba độ pha loãng lien tiếp nhau ). Đổ 10 đến 15 m l môi trường
YGC lê đĩa petri.
- Trộn đều bằng cách xoay đĩa petri theo hai chiều.
- Xếp các hộp trên mặt phẳng nằm ngang, để yên ( trong điều kiện vô trùng ) cho đến thạch nguội và đông hoàn toàn .
- Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm để nhiệt độ 30 ± 10C trong thời gian từ 48 đến 72 giờ.
3.3.6. Nuôi ủ mẫu
Để yên các đĩa petri trên mặt phẳng cho đến khi đông đặc hoàn toàn ( khoảng 10 phút ). Lật ngửa các đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 250C trong thời gian 5 đến 7 ngày.
3.3.7 Quan sát, đọc và xử lý kết quả
Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đem các hộp petri mà ta đã nuôi cấy ra đếm các khuẩn lạc nấm men – nấm mốc trên tất cả các đĩa cấy ( CFU/ml: CFU/g ).
Đếm bằng mắt thường hoặc qua kính phóng đại trong ánh đèn để đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri.
Nếu số khuẩn lạc mọc nhiều quá khó đếm thì chia đáy đĩa thành 2, 4, 8 phần đều nhau rồi đếm số khuẩn lạc mọc trên từng phần rồi lấy số khuẩn lạc đếm được của một phần nhân với hệ số đã chia .
Trường hợp không thể đếm ngay sau khi thời gian hấp chấm dứt, có thể giữ đĩa ở 40C không quá 24 giờ.
Sự phân bố khuẩn lạc phải hợp lý tức là số lần pha loãng càng cao thì số lượng khuẩn lạc càng thấp.
Số lượng nấm men – nấm mốc trung bình trong 1ml ( 1g ) mẫu được tính theo công thức:
v f n n N C
. ), 1 , 0
( 1 2 1
( CFU/ml,CFU/g)
Trong đó:
C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa
n1 : Số đĩa đếm ở đồng độ pha loãng thứ 1 ( độ pha loãng thấp nhất ) n2 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 ( độ pha loãng tiếp theo ) f1 : Hệ số pha loãng của đãi đếm thứ 1
v : Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri
Một người làm hai thí nghiệm song song, cho phép chênh lệch kết quả 5%. Hai người khác nhau, kết quả cho phép chênh lệch 10%.