CHƯƠNG 3: KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG KẸO CỨNG THEO CÁC CHỈ
3.5. Xác định ESCHERICHIA COLI
3.5.1.1. Nguyên tắc
Mẫu được pha loãng ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau mỗi độ pha loãng được cấy trong 3 (hoặc 5) ống nghiệm lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát và ghi nhận các ống dương tính và cấy tiếp sang mụi trường EC. Sau khi đó nuụi cấy ở nhiệt độ 440C thỡ theo dừi, kiểm tra cú sinh Indol không. Đếm số ống nghiệm nuôi cấy trên môi trường EC dương tính ứng với các ống có sinh Indol, tra bảng Mac Grady để suy ra số lượng E. Coli hiện diện trong mẫu phân tích.
3.5.1.2. Dụng cụ, thiết bị
- Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Ống Durham
- Ống nghiệm - Pipet
- Tủ sấy - Cồn 700
- Tủ hấp - Tủ ấm
- Tủ lạnh - Kéo, kẹp
3.5.1.3. Hóa chất, môi trường
- Môi trường TLS (Trytose Lauryl Sulfat).
- Môi trường EC.
- Môi trường canh thang lục sáng lactozơ mật bò 2% (Brilliant Green bile lactose Broth).
- Môi trường lỏng đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm chứa ống Durham
úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham.
- Dung dịch Trypon (pepton).
- Thuốc thử Indol.
3.5.1.4. Tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.
- Gieo cấy: Cấy 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1, 10-1, 10-3 vào các ống nghiệm có chứa môi trường TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống nghiệm lặp lại.
- Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C ± 10C trong thời gian 24 – 48 giờ. Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục (kết quả dương tính).
- Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ống nghiệm có chứa môi trường EC. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C ± 10C trong thời gian 48 giờ. Với mỗi độ pha loãng, tính tổng số (kết quả dương tính). sinh khí và đục ((kết quả dương tính).
Phép thử khẳng định:
- Kiểm tra hình thái:
Nhuộm gram, soi kính để xác định Gram (-), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống canh trường ria sang môi trường Endo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim (hay không có ánh kim), cấy tiếp sang môi trường thạch thường để thực hiện phản ứng IMVIC (các phản ứng này thực hiện độc lập nhưng đồng thời).
Phản ứng IMVIC * Phản ứng sinh indol:
- Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 440C ± 10C trong thời gian 48 giờ.
- Thêm 0,5ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm có chứa Trypton để nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết quả dương tính chứng tỏ có Indol) cho mỗi độ pha loãng.
* Phản ứng MR:
Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch đường vào môi trường Clark Lubs.
Nuôi tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 48 – 96 giờ. Sau đó hút 5ml canh khuẩn đó cho vào một ống nghiệm khác để dùng cho phản ứng VP. Môi trường Clark Lubs còn lại cho 5 giọt metyl đỏ 0,2% vào. Phản ứng dương khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử vào.
* Phản ứng VP:
Phương pháp 1: Cho 5ml dung dịch amonium sulfat đồng vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào.
Phương pháp 2: Cho 3ml dung dịch naphtol 5% và 1ml dung dịch KOH 40%
vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào.
* Phản ứng citrate:
Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Simmons Citrate. Nuôi tủ ấm 370C trong thời gian 24 giờ. Phản ứng dương khi môi trường đỏ chuyển sang xanh.
3.5.1.5. Kết quả
Với mức độ pha loãng, đếm số lượng ống nghiệm có màu đỏ (Indol dương tính),
xác định chỉ số MPN, từ đó tính được số E. Coli có trong 1g(1ml) mẫu phân tích.
3.5.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc 3.5.2.1. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactozơ. Trên môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliforms lên men đường lactozơ tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucshin- sulfit và giải phóng fucshin. Fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không.
Nếu khuẩn lạc màu hồng có ánh kim có thể giả định là E. Coli thì kiểm tra có sinh Indol hay không.
3.5.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Đĩa petri - Dụng cụ đồng nhất mẫu
- Ống nghiệm - Pipet
- Tủ sấy - Cồn 700
- Tủ hấp - Tủ ấm
- Tủ lạnh - Kéo, kẹp
3.5.2.3. Hóa chất, môi trường
- Môi trường thạch lactose lục đỏ sáng mật bò (Vilolet Bile Lactose Red Agar) - Môi trường EMB
- Môi trường Endo - Môi trường Istrati - Thuốc thử Indol
- Dung dịch Trypon (pepton)
3.5.2.4. Tiến hành
− Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.
− Gieo cấy: Cấy 1ml giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch.
− Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tử ấm ở nhiệt độ 370C ± 10C trong thời gian 48 – 72 giờ.
− Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim để tiến hành khẳng định đó là E.Coli.
Phép thử khẳng định:
Kiểm tra hình thái:
Nhuộm gram, soi kính để xác định Gram (-), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống canh trường ria sang môi trường Endo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim (hay không có ánh kim), cấy tiếp sang môi trường thạch thường để thực hiện phản ứng IMVIC (các phản ứng này thực hiện độc lập nhưng đồng thời).
Phản ứng IMVIC * Phản ứng sinh indol:
- Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 440C ± 10C trong thời gian 48 giờ.
- Thêm 0,5ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm có chứa Trypton để nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết
quả dương tính chứng tỏ có Indol) cho mỗi độ pha loãng.
* Phản ứng MR:
Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch đường vào môi trường Clark Lubs.
Nuôi tủ ấm 370C trong thời gian từ 48 – 96 giờ. Sau đó hút 5ml môi trường đó cho vào một ống nghiệm khác để dùng cho phản ứng VP. Môi trường Clark Lubs còn lại cho 5 giọt metyl đỏ 0,2% vào. Phản ứng dương khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử vào.
* Phản ứng VP:
Phương pháp 1: Cho 5ml dung dịch amonium sulfat đồng vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào.
Phương pháp 2: Cho 3ml dung dịch naphtol 5% và 1ml dung dịch KOH 40%
vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi xuất hiện màu đỏ trong vòng 15-20 phút sau khi cho thuốc thử vào.
* Phản ứng citrate:
Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Simmons Citrate. Nuôi tủ ấm 370C trong thời gian 24 giờ. Phản ứng dương khi môi trường đỏ chuyển sang xanh.
3.5.2.5. Kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E.Coli đã đếm được trên các đĩa, tổng số ống nghiệm thử Indol dương tính (có màu đỏ) và tổng số ống thử Indol để tính toán kết quả.
Số lượng E.Coli có trong 1ml (1g) mẫu được tính theo công thức:
v R f n n
N C .
. ).
1 , 0 ( 1 2 1
(CFU/ml, CFU/g)
Trong đó:
ΣC : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất các các đĩa
n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) n2 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) f1 : hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ
v: Thể tích mẫu cấy của mỗi đĩa petri
R: Số ống thử Indol dương tính (có màu đỏ)/tổng số ống thử Indol.
Xác định E. Coli gây bệnh khi phát hiện trực khuẩn Gram (-) với các đặc tính sinh hóa như sau:
Indol MR VB Citrae
E.Coli loại I + + - -
E.Coli loại II - + - -
3.6. Xác định CLOSTRIDIUM PERFRIGENS