M Ở ðẦ U
1.2.2. Nghiờn cứu về dịch chiết thực vật
Nhiều tài liệu cũng ủề cập ủến tỏc dụng của dịch chiết của cỏc loại cõy như Hành, Tỏi, Sả, Xoan, Rau ngải…ðỗ Chung Vừ và cộng sự trong cuốn “những cõy tinh dầu Việt Nam – khai thỏc – chế biến và sử dụng” ủó núi ủến tỏc dụng cỏc loài cõy này và cỏch chiết tỏch. Theo Phạm văn Lầm dịch chiết của những thực vật núi trờn là một phần trong biện phỏp sinh học trong bảo vệ thực vật. Ở Việt Nam, tỉnh Ninh Thuận ủó trồng trờn 2.000 ha cõy neem thành rừng cao 3-5m và cú kế hoạch trồng thờm ủến 10.000 ha trong những năm tớị Tỉnh Bỡnh Thuận cũng ủó trồng ủược khoảng 350 hạ
Hiện nay cú một số cơ quan trong nước ủó nghiờn cứu thành phần húa học của lỏ neem, nghiờn cứu sử dụng hạt neem làm thuốc bảo vệ thực vật (VIPESCO), nhưng chưa cú cơ quan nào nghiờn cứu sử dụng cõy neem ủể làm thuốc trị bệnh. Năm 2006, UBND tỉnh Ninh Thuận ủó ủồng ý cho Trung tõm nghiờn cứu Hoỏ sinh ứng dụng Hoỏ sinh TP.HCM tiến hành nghiờn cứu chiết suất nhúm Limonoid trong lỏ, cành và quả hạt Neem thu hỏi từ rừng Neem xó Phước Dinh (huyện Ninh Phước) ủó ly trớch hoạt chất cõy Neem và chế biến thành 3 loại sản phẩm theo tiờu chuẩn dược phẩm của Ấn ðộ, gồm:
Thuốc viờn Neemtab dựng ủể uống với thành phần hoạt chất chớnh là cao trớch ly từ cành và lỏ cõy neem. Thử nghiệm tỏc dụng của dung dịch thuốc Neemtab 20-50% ủối với 5 chủng vi khuẩn thường gõy bệnh cho người và gia sỳc nh : Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Salmonella sp, và Vibrio cholera cho thấy vũng vụ khuẩn cú ủường kớnh khỏ lớn 8-16mm. Thử nghiệm tỏc dụng của thuốc Neemtab ủối với cỏc loại nấm bệnh như nấm Trichosporon, Geotrichum, Candida-a, Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum theo phương phỏp Agar dilution và tớnh tỷ lệ ức chế I%, kết quả cho thấy ở cỏc nghiệm thức cú xử lý dung dịch huyền phự Neemtab 50% ủều cú sựức chế phỏt triển của 6 loại nấm trờn, tỷ lệức chế sau 4 ngày vào khoảng 51,24-100% tựy loại nấm.
Thuốc Neemgel dạng phun sương cú thành phần hoạt chất chớnh là cao trớch ly từ cành lỏ neem và dầu neem. Thử nghiệm khả năng diệt khuẩn của dung dịch Neemgel 1% ủối với cỏc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
cho thấy thuốc Neemgel 1% cú tỏc dụng diệt ủược cỏc vi khuẩn nầỵ Thuốc Neemcream dạng thuốc kem cú thành phần hoạt chất chớnh là cao trớch ly từ cành lỏ neem và dầu neem. Thử nghiệm hoạt tớnh khỏng khuẩn của Neemcream 2% limonoid ủối với cỏc vi khuẩn Candida albicans, S. aureus, Salmonella cho thấy Neemcream cú tỏc dụng tốt diệt cỏc vi khuẩn nầy, vũng vụ khuẩn cú ủường kớnh khoảng 8 - 9mm. Thử nghiệm hoạt tớnh diệt khuẩn ủối với 5 chủng P. aeruginosa, V. cholerae, Ẹ coli, S. aureus, B. subtilis nuụi cấy trờn mụi trường Mueller Hinton Agar cho thấy Neemcream cú tỏc dụng tốt diệt cỏc chủng vi khuẩn nàỵ (nguồn Phạm Chõu Hoành - Sở KH&CN Ninh Thuận)
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1 ðối tượng, ủịa ủiểm nghiờn cứu và thời gian thực hiện
2.1.1 ðối tượng nghiờn cứu
Một số nấm bệnh gõy hộo rũ lạc: Hộo rũ gốc mốc ủen và hộo rũ gốc mốc trắng.
2.1.2 ðịa ủiểm nghiờn cứu
+ Cỏc xó trồng lạc quanh ủịa bàn Gia Lõm, Hà Nội
+ Phũng thớ nghiệm bộ mụn Bệnh cõy, Trung Tõm Bệnh Cõy Nhiệt ðới, trường ủại học Nụng Nghiệp Hà Nộị
+ Thu thập cỏc mẫu hành, tỏi, sả ủể tiến hành lấy dịch chiết tại Gia Lõm, Hà Nộị
2.1.3 Thời gian nghiờn cứu
Từ thỏng 6 năm 2012 ủến thỏng 2 năm 2013
2.2 Vật liệu nghiờn cứu
+ Giống lạc BT 14, BT 7
+ Cõy hành, tỏi , sả, chế phẩm trichoderma
+ Dụng cụ thớ nghiệm: Dụng cụ trong phũng thớ nghiệm ủĩa Petri, ống nghiệm, giỏ ủựng ống nghiệm, Cỏc loại nguyờn liệu nấu mụi trường PGA ẳ.
2.3 Nội dung nghiờn cứu
2.3.1 ðiều tra thành phần nấm bệnh gõy hại lạc ngoài ủồng ruộng trồng tại Gia Lõm, Hà Nội vụ thu ủụng năm 2012
2.3.2 Giỏm ủịnh nấm bệnh gõy hại hạt giống lạc thu thập tại vựng Gia Lõm, Hà Nội bằng phương phỏp giấy thấm.
2.3.3 ðiều tra diễn biến nấm gõy bệnh hộo rũ lạc trồng tại Gia Lõm, Hà Nội, vụ thu ủụng năm 2012.
2.3.4 ðỏnh giỏ ảnh hưởng của một số dịch chiết thực vật ủến khả năng n y m m, s c s ng c a m m c a h t gi ng l c trong nhà l ị
2.3.5 So sỏnh cỏc cỏch chiết và dung mụi chiết dịch chiết thực vật khỏc nhau ảnh hưởng ủến khả năng nảy mầm, và tỷ lệ nấm bệnh trờn hạt giống lạc BT 14 và DT 7.
2.3.6 ðỏnh giỏ ảnh hưởng của một số dịch chiết thực vật và chế phẩm
Trichoderma spp. ủến mức ủộ phỏt sinh, phỏt triển của nấm gõy bệnh hộo rũ hại lạc trong phũng thớ nghiệm, nhà lướị
2.3.7 ðỏnh giỏ hiệu quả phũng trừ bệnh hộo rũ gốc mốc ủen và hộo rũ gốc mốc trắng gõy hại lạc của một số dịch chiết thực vật và chế phấm
Trichoderma spp. ngoài ủồng ruộng tại Gia Lõm, Hà Nội năm 2012.
2.4 Phương phỏp nghiờn cứu
2.4.1 Phương phỏp giỏm ủịnh bệnh hại trờn hạt giống lạc
Giỏm ủịnh nấm gõy hại hạt giống theo tài liệu giỏm ủịnh bệnh hại hạt giống của viện nghiờn cứu Bệnh hạt giống ðan Mạch (Mathur và Olga, 2001), kiểm tra nấm bệnh tồn tại trờn hạt giống bằng phương phỏp giấy thấm.
- Phương phỏp chia mẫu: mẫu hạt giống ủược trải ủều trờn mặt phẳng hỡnh trũn. Chia mặt phẳng làm 4 phần ủều nhaụ Lấy mỗi phần một lượng nhất ủịnh sau ủú trộn ủều sao cho ủủ lượng mẫu kiểm trạ Lượng mẫu kiểm tra: 200 hạt.
- Phương phỏp giỏm ủịnh nấm bệnh hại trờn hạt giống lạc bằng phương phỏp giấy thấm: ðặt 10 hạt trờn 1 ủĩa petri trong cú giấy thấm ủó ủược làm ẩm bằng nước cất vụ trựng. ðặt hạt thành 2 vũng, vũng ngoài 9 hạt sao cho khoảng cỏch cỏc hạt ủều nhau, vũng trong 1 hạt ủặt ở chớnh giữa ủĩa petrị Sau ủú ủặt chỳng trong phũng ủủảm bảo 12h sỏng, 12h tối ở nhiệt ủộ 22 – 250 C. Sau 7 ngày kiểm tra mẫu, soi hạt dưới kớnh lỳp ủiện lần lượt từ vũng ngoài vào vũng trong theo tõm ủĩa, ủối với nấm chưa xỏc ủịnh rừ thỡ phải khều ủược bào tử nấm ủể soi dưới kớnh hiển vị
ðỏnh giỏ mức ủộ phổ biến của bệnh theo thang 4 cấp sau: + : Tỷ lệ hạt nhiễm nấm < 5%
+++ : Tỷ lệ hạt nhiễm nấm ≥15% - 25% ++++ : Tỷ lệ hạt nhiễm nấm ≥ 25%
2.4.2 Phương phỏp kiểm tra sức nảy mầm của hạt giống
Theo phương phỏp của hội kiểm nghiệm hạt giống quốc tế (ISTA, 2003) và tiờu chuẩn ngành kiểm nghiệm hạt giống.
- Phương phỏp giấy thấm TP (Top of paper) ðặt hạt ủược kiểm tra sức nảy mầm lờn trờn lớp giấy thấm ủó no nước trong cỏc dụng cụ Jacobsen (cú thể thay thế dụng cụ Jacobsen bằng hộp nhựa, ủĩa Petri). ðậy nắp hộp hoặc cho vào tỳi nilon ủể giảm tối thiểu sự bay hơi nước và ủể giữ ẩm cho giấy thấm. ðặt hộp trong tủ nảy mầm hoặc trong buồng nảy mầm ủ ở ủiều kiện nhiệt ủộ 20 – 250C. Kiểm tra sức nảy mầm của mẫu hạt qua sau 5 hoặc 7 ngày, ủếm số mầm bỡnh thường, ghi số lượng vào bảng ủiều tra (dựa theo tiờu chuẩn ủó quy ủịnh ủể xỏc ủịnh mầm bỡnh thường, mầm bất bỡnh thường, hạt thối, hạt tươi). Tớnh số mầm bỡnh thường cho cả 2 lần ủếm ủể xỏc ủịnh tỉ lệ nảy mầm của hạt.
- Phương phỏp cỏt ẩm S (Sand) ðặt hạt trờn cỏt vụ trựng ủó ủược phun ủủẩm và cũng tiến hành kiểm tra sức nảy mầm của hạt như phương phỏp giấy thấm.
Tiến hành kiểm tra 200 hạt/ mẫu, 50 hạt hoặc 100 hạt cho một lần nhắc lại tựy vào kớch thước của hạt.
2.4.3 Phương phỏp ủiều tra thành phần và mức ủộ phổ biến nấm bệnh hại lạc ngoài ủồng
Phương phỏp ủiều tra ngoài ủồng ruộng ỏp dụng theo phương phỏp nghiờn cứu Bảo vệ thực vật của viện bảo vệ thực vật năm 2006.
Chọn 1 ủiểm ủiều tra trờn một xó trồng lạc ủại diện cho giống lạc phổ biến (Giống lạc BT 14, DT 7) tại vựng Gia Lõm, Hà Nộị Mỗi ủiểm ủiều tra chọn 3 ruộng lạc (mỗi ruộng ủiều tra trờn 250 m2). ðiều tra theo phương phỏp 5 i m ng chộo gúc t i m i ru ng, m i i m 50 cõy i v i b nh gõy ch t
cõy và 5 cõy ủối với bệnh gõy hại trờn lỏ lạc, ủiều tra ủịnh kỳ 7 ngày 1 lần từ giai ủoạn cõy con ủến khi thu hoạch. Quan sỏt triệu chứng trờn toàn bộ cõy trồng ởủiểm ủiều tra, ủỏnh giỏ mức ủộ phổ biến của bệnh ở từng cấp.
2.4.3.1 ðiều tra tỡnh hỡnh phỏt sinh, phỏt triển của hộo rũ gốc mốc ủen, hộo rũ gốc mốc trắng tại Gia Lõm, Hà Nội
Chọn 1 ủiểm ủiều tra trờn một xó trồng lạc ủại diện cho giống lạc phổ biến (Giống lạc BT14) tại vựng Gia Lõm, Hà Nộị Mỗi ủiểm ủiều tra chọn 3 ruộng lạc (mỗi ruộng ủiều tra cú diện tớch trờn 250 m2). ðiều tra theo phương phỏp 5 ủiểm ủường chộo gúc tại mỗi ruộng, mỗi ủiểm 50 cõy, ủiều tra ủịnh kỳ 7 ngày 1 lần từ giai ủoạn cõy con ủến thời kỳ cõy ra hoạ ðiều tra diễn biến bệnh hộo rũ gốc mốc ủen do nấm Aspergillus niger và bệnh hộo rũ gốc mục trắng Sclerotium rolfsii.
Chẩn ủoỏn bệnh ngoài ủồng ruộng: Dựa vào triệu chứng biểu hiện bệnh bờn ngoài ủiển hỡnh.
Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ bệnh (%).
2.4.4 Phương phỏp thu dịch chiết thực vật
* Phương phỏp thu dịch chiết thụ
- Lấy 100g mỗi loại hành, tỏi, sảủó ủược làm sạch và làm khụ. Nghiền lỏt mỗi loại dịch chiết riờng biệt và ngõm trong 100ml nước tinh khiết. Lọc lấy phần nước ta thu ủược dịch chiết thụ. Sau ủú cú thể lưu trữở tủ lạnh 40C
- Pha loóng dịch chiết mỗi loại với nước cất ủể thu ủược dịch chiết 5 %, 10%, 15%, 20% bằng cỏch lấy tương ứng 5ml, 10ml, 15 ml ở mỗi loại + với 95ml, 90ml,85 ml nước cất ta thu ủược nồng ủộ mong muốn.
* Phương phỏp thu dịch chiết tinh (Chiết với cồn 70o)
- Lấy 100g mỗi loại hành, tỏi, sảủó ủược làm sạch và làm khụ. Nghiền lỏt mỗi loại dịch chiết riờng biệt cựng với 100 ml cồn 70o Lọc lấy phần nước ta thu ủược dịch chiết thụ. Sau ủú ủem ly tõm với tốc ủộ 3000 vũng/ phỳt. Ta thu ủược dịch chiết tinh.
- Pha loóng dịch chiết mỗi loại với nước cất ủể thu ủược dịch chiết 5 %, 10%, 15% bằng cỏch lấy tương ứng 5ml, 10ml, 15 ml ở mỗi loại + 95ml, 90ml,85 ml nước cất ta thu ủược nồng ủộ mong muốn.
2.4.5 Phương phỏp nghiờn cứu ảnh hưởng của dịch chiết thực vật và chế
phẩm Trichoderma ủến hiệu quả phũng trừ bệnh
2.4.5.1 Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng thớ nghiệm.
* Phương phỏp nấu mụi trường PDA ẳ cấy nấm A.niger và Sclerotium
rolfsii
Thành phần:
+ Khoai tõy: 50g + Agar: 20g
+ Glucose: 5g + Nước cất: 1000ml
Cỏch nấu: 50g khoai ủó gọt vỏ, rửa sạch, thỏi nhỏ, ủun sụi với 1l nước cất, lọc lấy nước trong sau ủú thờm vào 20g agar, 5g glucose và nước vào cho ủủ 1 lớt, hũa tan rồi ủưa lờn bếp ủun lại, vừa ủun vừa khuấy ủều ủể cho agar khụng bị vún ủến sụi lăn tăn sau ủú cho hấp vụ trựng trong 30 phỳt và ủổ vào ủĩa petrị
* Phương phỏp xử lý hạt giống: Tiến hành thớ nghiệm với giống lạc L14, ngõm hạt với dịch chiết tỏi, hành, sả 5%, 10%, 15% và chế phẩm cheatomium với nồng ủộ 0,05%, 0,1%trong cỏc khoảng thời gian 5 phỳt, 10 phỳt, 15 phỳt, sau ủú ủặt hạt theo phương phỏp giấy thấm. Sau ủú so sỏnh với cụng thức ủối chứng khụng xử lý cỏc dịch chiết và chế phẩm núi trờn.
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi bao gồm:
+ Tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm Ạ niger và Sclerotium rolfsii trong cỏc cụng thức thớ nghiệm và cụng thức ủối chứng khụng xử lý dịch chiết thực vật hay chế phẩm sinh học
+ Ảnh hưởng của cỏc dịch chiết thực vật và chế phẩm sinh học trờn ủến sức sống của mầm
+ Xỏc ủịnh tỷ lệ mầm bỡnh thường và mầm bất bỡnh thường ở cỏc cụng thức. Cụng thức nào cho tỷ lệ mầm bỡnh thường cao nhất sẽ tiếp tục ủưa vào thớ nghiệm nhà lướị
2.4.5.2 Phương phỏp nghiờn cứu trong nhà lưới
- Tiến hành thớ nghiệm trong chậu vạị Mỗi chậu (ủường kớnh 20 cm) gieo 5 cõy với lạc trờn ủất phự sa ủó khử trựng.
- Thiết kế thớ nghiệm theo kiểu khối ngẫu nhiờn ủầy ủủ, mỗi cụng thức 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 50 cõy và cú ủối chứng.
2.4.5.2.1 Thớ nghiệm xử lý dịch chiết thực vật.
a, Lõy nhiễn nấm Ạ niger xử lý dịch chiết thụ.
• Lõy nhiễm nấm Ạ niger vào hạt giống, ủất. * Thớ nghiệm 1: Thử nghiệm ở nồng ủộ 5%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Ạ niger
CT2: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết tỏi 5% CT3: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết sả 5%
CT4: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và chế phẩm sinh học Trichoderma. * Thớ nghiệm 2: Thử nghiệm ở nồng ủộ 10%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Ạ niger
CT2: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết tỏi 10% CT3: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết sả 10% * Thớ nghiệm 3: Thử nghiệm ở nồng ủộ 15%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Ạ niger
CT2: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết tỏi 10% CT3: Lõy nhiễm nấm Ạ niger và xử lý dịch chiết sả 10% * Thực hiện tương tự cỏc thớ nghiệm trờn với dịch chiết với cồn.
• Lõy nhiễm nấm Ạ niger với phương phỏp lõy nhiễm khi cõy ủược 2 lỏ mầm.
- Cỏc thớ nghiệm ủược bố trớ tương tự như trờn: Dung dịch bào tử nấm
Ạ niger với số bào tử 23. 109 cfụ Phun vào ủất và cõy con khi cõy ủược 2 lỏ mầm.
b. Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsiị
• Thử nghiệm dịch chiết thụ cựng chế phẩm sinh học.
* Thớ nghiệm 1: Thử nghiệm ở nồng ủộ 5%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii
CT2: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết tỏi 5% CT3: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết sả 5% CT4: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và chế phẩm sinh học
Trichoderma spp.
* Thớ nghiệm 2: Thử nghiệm ở nồng ủộ 10%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii
CT2: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết tỏi 10% CT3: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết sả 10% CT4: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và chế phẩm sinh học
Trichoderma spp.
* Thớ nghiệm 3: Thử nghiệm ở nồng ủộ 15%
CT1 (CTðC): Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii
CT2: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết tỏi 5% CT3: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và xử lý dịch chiết sả 5% CT4: Lõy nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và chế phẩm sinh học
Trichoderma spp.
• Tiến hành thớ nghiệm tương tự với dịch chiết tinh ( dịch chiết cồn) Cỏch tiến hành thớ nghiệm
- Ủ hạt: Ngõm hạt giống với nước ấm (2 sụi + 3 lạnh) trong 12 h, ủể rỏo nước và ủ vào vải ẩm.