(Nguồn: Sonal Patel và cộng sự, 2019 )80
1.3.5.3. Tình hình nghiên cứu đa hình của gen LRP5 đến GTĐS do loãng xương
Kết quả khám phá ra tầm quan trọng của LRP5 trong chuyển hóa xương dẫn đến khám phá ra vai trò của LRP5 là gen ứng viên trong q trình điều hịa MĐX và/ hoặc nguy cơ gãy xương trong quần thể dân số. LRP5 là một trong số rất ít gen có mặt trong hầu hết các nghiên cứu GWAS.
Năm 2009, trong nghiên cứu liên quan đến 19 000 cá thể, tác giả Richards et al. phân tích 36 000 đa hình đơn nucleotide (SNPs) trong 150 gen ứng cử viên thấy LRP5 là 1 trong 4 gen (SPP1, SOST, LRP5, TNFRSF11A ) có liên
Năm 2012, Estrada và cộng sự tiến hành một nghiên cứu cộng gộp 17 nghiên cứu GWAS: trong 6 gen liên quan đến gãy xương do lỗng xương có gen LRP5.36
Tại vị trí SNP rs3736228 (A1330V) có sự thay thế nucleotid C (Cytosine) thành T (Thymine) dẫn đến trong quá trình tổng hợp acid amin thay thế Alanin thành Valin. Đa hình A1330V có liên quan đáng kể với BMD CSTL và xương đùi trên nhóm người bệnh lỗng xương người Anh81 và phụ nữ mãn kinh da trắng.82
Các nghiên cứu trên phụ nữ mãn kinh Hy Lạp83 và người Maya-Mestizo84
đều tìm thấy sự liên quan của gen LRP5 với MĐX CXĐ và CSTL. Tuy nhiên các nghiên cứu về sự liên quan của gen này với MĐX và loãng xương trên phụ nữ Châu Á thì cịn đang tranh cãi. Tác giả Anong và Hồ Phạm Thục Lan đều khơng tìm thấy mối liên quan giữa gen LRP5 với MĐX ở phụ nữ Thái Lan và miền Nam Việt Nam.60 Ezura nghiên cứu trên 308 phụ nữ Nhật Bản thấy rằng các biến thể của gen LRP5 có vai trò quan trọng ảnh hưởng đến MĐX và
A1330V là biến thể góp phần gây ra lỗng xương ít nhất là trên phụ nữ
Nhật.85Do đó, nghiên cứu làm rõ thêm mối quan hệ giữa gen LRP5 với loãng xương và gãy thân đốt sống do loãng xương trên phụ nữ Châu Á là cần thiết.
Đây là nghiên cứu về gen liên quan đến gãy thân đốt sống do loãng xương đầu tiên tại Việt Nam trên đối tượng phụ nữ sau mãn kinh. Chúng tôi lựa chọn nghiên cứu 3 điểm gen (MTHFR rs1801133, FTO rs11211980 và LRP5 rs41494349) dựa vào cơ chế bệnh sinh rõ ràng và một số nghiên cứu trên thế
giới thấy có mối liên quan với nguy cơ gãy xương do loãng xương. Hơn nữa, dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu như kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System – PCR: Kỹ thuật sử dụng hệ thống khuếch đại đột biến), RFLP-PCR (Restriction
Fragment Length Polymorphism - PCR: Kỹ thuật xác định các loại chiều dài phân đoạn DNA của các đa hình gen bằng enzym cắt giới hạn), ASP-PCR (Allelen Specific-PCR: phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu alen), Real-Time multiplex PCR, giải trình tự gen trực tiếp (Sequencing).
Tình hình nghiên cứu về tính đa hình của các gen liên quan đến gãy thân đốt sống loãng xương trên thế giới và tại Việt Nam rất phong phú với các phương tiện kĩ thuật nghiên cứu đa dạng và yêu cầu trình độ cao. Phụ nữ sau mãn kinh là đối tượng có tỉ lệ lỗng xương gặp nhiều nhất, tốc độ mất xương cao nhất và có nguy cơ gãy thân đốt sống cao nhất, do đó nhóm đối tượng này cần được ưu tiên hàng đầu. Nghiên cứu tính đa hình của một số gen liên quan đến gãy thân đốt sống do loãng xương ở phụ nữ sau khi triển khai tại cộng đồng nhằm tìm ra hướng tiếp cận tối ưu và phù hợp với nguồn lực ở Việt Nam để đưa ra giải pháp nhằm nâng cao sức khỏe cho quần thể đích của nghiên cứu.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
Các đối tượng lựa chọn trong nghiên cứu đáp ứng đủ tiêu chuẩn sau: Phụ nữ mãn kinh tự nhiên ≥ 40 tuổi. (Mãn kinh tự nhiên được định nghĩa là mất kinh liên tục từ 12 tháng trở lên)
Có kết quả đo mật độ xương theo phương pháp DEXA tại vị trí cổ xương đùi và cột sống thắt lưng tại các vị trí L1, L2, L3 và L4.
Có kết quả X-quang cột sống ngực (CSN), cột sống thắt lưng (CSTL) ở hai tư thế thẳng – nghiêng, chia người bệnh thành 2 nhóm:
Nhóm bệnh: Nếu kết quả X-quang cột sống ngực (CSN) hoặc cột
sống thắt lưng (CSTL) có gãy thân đốt sống theo phương pháp đo định lượng (Eastell) tính theo giá trị tham chiếu cho người Việt Nam. Nhóm chứng: Nếu kết quả X-quang cột sống ngực (CSN) hoặc cột
sống thắt lưng (CSTL) khơng có gãy thân đốt sống theo phương pháp đo định lượng (Eastell) tính theo giá trị tham chiếu cho người Việt Nam.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
Người bệnh có tiền sử mắc các bệnh mạn tính gây lỗng xương thứ phát như bệnh gan, thận mạn tính, ung thư, các bệnh nội tiết và các rối loạn liên quan chuyển hóa Vitamin D, chuyển hóa xương như như đái tháo đường, hội chứng kém hấp thu, bệnh cường giáp trạng, hội chứng Cushing.
Người bệnh sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa canxi và vitamin D trong 6 tháng vừa qua như: corticoid, hormon thay thế, heparin, bisphosphonate.
Người bệnh bị cắt bỏ tử cung/buồng trứng, hoặc đang mang thai và cho con bú.
Người bệnh không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2016 đến tháng 10/2018 tại khoa Cơ xương khớp, Khoa Khám bệnh – Bệnh viện Bạch Mai và Bộ môn Sinh lý học Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu:
- Mục tiêu 1: Mô tả cắt ngang
- Mục tiêu 2: Nghiên cứu bệnh chứng
2.3.2. Cỡ mẫu
*Cỡ mẫu cho mục tiêu 1
Dựa vào công thức mô tả cắt ngang: n=Z21-α/2 p(1-p)
(d)2 Trong đó:
n: cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu p: tỷ lệ gãy thân đốt sống, p = 0,2626
d: là khoảng cách sai lệch tương đối, chọn là 0,05. Z(1- /2): hệ số tin cậy 95% có giá trị là 1,96.
Thay vào công thức ta được cỡ mẫu tối thiểu là 296 người bệnh. Thực tế thì chúng tơi thu nhận được 328 người bệnh.
*Cỡ mẫu cho mục tiêu 2
Cỡ mẫu trong mơ hình tương tác giữa gen và mơi trường, cỡ mẫu được tính theo phần mềm QUANTO cho nghiên cứu bệnh chứng ghép cặp. Dựa trên
các thơng số được ước tính từ nghiên cứu trước đây ở Việt nam và các chủng tộc Châu Á:
Tỉ lệ loãng xương là 26% ở sau tuổi 40.26 Số SNP đưa vào khảo sát = 3.
Sai số loại I (α): 0,001 với giả thuyết kiểm định hai phía đã điều chỉnh; lực mẫu là 0,80.
Tỉ lệ alen quan tâm (minor allen) là 0,15-0,40; với mơ hình di truyền cộng hợp (log additive inheritance mode).
Tỉ lệ đối tượng có yếu tố mơi trường tương tác: 0,25-0,4. Ảnh hưởng chính về di truyền (main effect of genetics): 1,25.
Ảnh hưởng chính về mơi trường (main effect of environment): 1,25. Ảnh hưởng tương tác về gen-môi trường: 4,0-6,0.
Tỉ lệ bệnh chứng = 1:3.
Cỡ mẫu tính được là tối thiểu 324 đối tượng cả hai nhóm bệnh và chứng. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn được tổng cộng 328 đối tượng nghiên cứu. Chúng tôi lựa chọn ghép cặp về tuổi trung bình, tuổi mãn kinh và thời gian mãn kinh của 82 người bệnh gãy thân đốt sống với 246 người bệnh không gãy thân đốt sống theo tỉ lệ bệnh/chứng là 1/3.
2.3.3. Quy trình khám lâm sàng và lấy máu làm xét nghiệm gen
‒ Địa điểm thực hiện: Khoa Cơ Xương Khớp và Khoa Khám bệnh – Bệnh viện Bạch Mai.
Phụ nữ mãn kinh tự nhiên ≥ 40 tuổi đến khám tại khoa Khám bệnh và khoa Cơ Xương Khớp – Bệnh viện Bạch Mai sẽ được các bác sỹ chuyên ngành Nội – Xương khớp khám lâm sàng, phỏng vấn theo một bộ câu hỏi sàng lọc. Người bệnh được làm các xét nghiệm lâm sàng, cận lâm sàng để tiếp tục loại trừ các bệnh trong tiêu chuẩn loại trừ. Những người bệnh thoả mãn tiêu chuẩn lựa chọn sẽ được lấy máu phân tích gen, chụp
Xquang cột sống ngực – cột sống thắt lưng thẳng nghiêng và đo mật độ xương bằng phương pháp DEXA.
Tất cả các đối tượng thỏa mãn tiêu chuẩn nghiên cứu được lấy bệnh phẩm là 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA. Bệnh phẩm lấy buổi sáng, lúc đói, sau đó 300μl máu chống đơng được sử dụng để tiến hành tách chiết DNA. Số còn lại và bệnh phẩm chưa phân tích ngay sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C, thực hiện tại bộ môn Sinh lý – Đại học Y Hà Nội (quy trình tại mục 2.4.3).
2.3.4. Quy trình đo mật độ xương theo phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép (DEXA-Dual Energy X-ray Absorption) lượng kép (DEXA-Dual Energy X-ray Absorption)
‒ Địa điểm thực hiện: Bệnh viện Bạch Mai.
Thiết bị sử dụng: Máy Explorer của hãng Hologic – Mỹ tại Bệnh viện Bạch Mai, là máy đo hấp thụ tia X năng lượng kép thế hệ 3 chùm tia hình dẻ quạt góc rộng, có hệ thống tự động định kích cỡ, mức sai số 1%. Khoảng cách các vùng quét: 1mm. Thời gian quét: 5-7 phút. Liều tia thấp 2-4mrem. Nguồn điện sử dụng: 110VAC-5A-60H. Bảo quản máy ở nhiệt độ: 18-27oC
Vị trí đo và phân tích kết quả: tại CSTL và CXĐ
+ Tại CSTL: đo ở 4 vị trí từ L1 đến L4. Khối lượng xương được đo ở mặt
cắt theo chiều trước sau ở từng vùng tương ứng với vùng đo MĐX. Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bình cộng của các chỉ số vùng đo. MĐX hiển thị bằng chỉ số BMD (g/cm2). Chẩn đốn lỗng xương dựa trên tiêu chuẩn của WHO sử dụng chỉ số T.
+ Tại CXĐ: đo tại 4 vị trí là CXĐ, tam giác Ward, mấu chuyển lớn, liên
mấu chuyển. Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ở từng vùng tương ứng với vùng đo MĐX. Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bình cộng của các chỉ số vùng đo. MĐX hiển thị bằng chỉ số BMD (g/cm2.). Chẩn đốn lỗng xương dựa trên tiêu chuẩn của WHO sử dụng chỉ số T.
Sau khi đã đo BMD, người ta tính chỉ số T (T-score) là chỉ số BMD của cá thể đó so với BMD tối đa của quần thể trẻ tuổi làm chuẩn. BMD tối đa phải được ước tính từ một quần thể mang tính đại diện cao cho một dân tộc (vì BMD khác biệt giữa các dân tộc). Chỉ số T được tính theo cơng thức sau đây:
𝑇 =𝑖𝐵𝑀𝐷 − 𝑝𝐵𝑀𝐷 𝑆𝐷
- iBMD là mật độ xương của đối tượng i.
- pBMD là mật độ xương tối đa của quần thể trong độ tuổi 20-30 (còn gọi là mật độ xương đỉnh – peak bone mineral density).
- SD là độ lệch chuẩn của BMD trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30. Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương theo WHO như sau:
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương của WHO
T-score Chẩn đoán
Chỉ số T cao hơn -1 Bình thường
Chỉ số T trong khoảng -2,5 đến -1,0 Thiếu xương Chỉ số T thấp hơn hoặc bằng -2,5 Loãng xương
Loãng xương + tiền sử gãy xương gần đây Lỗng xương nghiêm trọng Giá trị BMD tính theo giá trị tham chiếu của người Việt Nam (Bảng 2.2)
Bảng 2.2. Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) trong quần thể của phụ nữ Việt Nam đo bằng máy Hologic
Vị trí xương Mật độ xương đỉnh pBMD (SD)
Tuổi mật độ xương đạt đỉnh
Cổ xương đùi 0,80 (0,10) 25
Đầu trên xương đùi 0,86 (0,10) 32
Cột sống thắt lưng 0,98 (0,11) 30
2.3.5. Quy trình chụp X quang và phân loại gãy xương theo phương pháp định lượng định lượng
Địa điểm thực hiện: Trung tâm Điện Quang – Bệnh viện Bạch Mai Thiết bị sử dụng
Máy DR TITAN 2000 Dual CCD - Hàn Quốc. Người bệnh sẽ được chụp 2 phim ở tư thế nghiêng 90 độ, một phim cột sống lưng từ D4-D12, một phim CSTL từ D12-L5.
Tư thế chụp
Cột sống của người bệnh song song với bàn chụp, tránh quay, vẹo, dễ gây nghiêng đốt sống. Nếu chụp ở tư thế nằm trục cột sống thường nghiêng theo hướng L1 – L5, phải đặt miếng thấu xạ ở phần trên thắt lưng; hoặc xoay gốc tia X về hướng chân, vng góc với đốt sống.
Phân tích kết quả: Phương pháp định lượng (Eastell) dựa vào bảng tham chiếu kích thước đốt sống của Hồ Phạm Thục Lan54, đo kích thước đốt sống bằng phần mềm Image J 1.44
Ở mỗi đối tượng nghiên cứu chúng tôi đo chiều cao của 14 đốt sống (9 đốt sống ngực từ D4 đến D12, 5 đốt sống thắt lưng từ L1 đến L5).
Bảng 2.3. Thông số Ha/Hp, Hm/Hp, Hp(i)/Hp(i+1) và Hp(i)/Hp(i-1) ở nữ
Bảng 2.4. Thông số Ha, Hm, Hp của đốt sống ở nữ
(Nguồn: Hồ Phạm Thục Lan, 2011)
Bảng 2.5. Thông số Ha, Hm, Hp của đốt sống theo độ tuổi ở nữ
Trên X – quang nghiêng thân đốt sống được chia thàng 3 trục: trước, giữa và sau bằng cách đặt 6 điểm trên phim, 3 điểm ở đĩa cùng trên và tương ứng 3 điểm ở đĩa cùng dưới. Image J sẽ cho kết quả cụ thể chiều cao thân trước (anterior height, Ha), giữa (middle height, Hm), sau (posterior height, Hp). Sau khi có được 3 thơng số chiều cao của 14 đốt sống, tính 4 tỉ số như sau: Ha/Hp và Hm/Hp được sử dụng để đánh giá gãy bờ đốt sống và gãy đĩa, Hp(i)/Hp(i+1) và Hp(i)/Hp(i-1) để đánh giá độ lún. Sau đó đối chiếu với trị số tham chiếu: chẩn đoán gãy xương khi thay đổi bất kỳ một tỷ lệ chiều cao nào dưới 3 lần so với độ lệch chuẩn. Khi có bất kỳ một tỷ số nào của một thân đốt sống mà có - 4SD <tỷ số<-3SD thì chẩn đốn là gãy xương độ I, và tỷ số ≤ -4SD được chẩn đoán là gãy xương độ II. Nguyên tắc đặt điểm: 2 điểm bên ở tận cùng mép của đĩa cùng, điểm giữa ở chính giữa.