CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương tiện nghiên cứu
2.4.3. Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương
đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 1000 (Thermo):
‒ Địa điểm thực hiện: Labo Sinh lý tế bào, Bộ môn Sinh lý học, Trường Đại học Y Hà Nội.
Máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA. DNA tổng số được tách từ tế bào bạch cầu sử dụng bộ Kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA). Các bước tiến hành như sau: Bước 1: Ly giải tế bào hồng cầu và thu bạch cầu
Lấy 300 μl máu toàn phần vào ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 900 μl dung dịch Cell Lysis Solution.
Đảo ống 5 - 6 lần, sau đó ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng . Ly tâm ở 14.000 xg trong 40 giây ở nhiệt độ phòng.
Loại bỏ tối đa dung dịch nổi, không được chạm vào hạt tủa ở đáy ống, còn lại khoảng 20μl cặn trong ống.
Lặp lại 2 lần các bước trên.
Bước 2: Ly giải màng bạch cầu và màng nhân, thủy phân RNA
Thêm 300μl Nucleic Lysis Solution
Vortex rồi ủ ở 37oC trong 30 phút tới khi cặn tan hoàn toàn. Làm mát ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Thêm 1,5μl dung dịch RNase Solution, đảo đầu ống 5 lần. Ủ ở 37oC trong 30 phút.
Bước 3: Loại bỏ protein
Thêm 130μl Protein Precipitation Solution.
Vortex mạnh rồi ly tâm 14.000 xg trong 3 phút ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp phân thành lớp gồm tủa màu nâu ở đáy ống, dung dịch trong suốt chứa DNA ở trên.
Bước 4: Thu DNA và bù nước
Thu lớp trên cùng trong suốt chứa DNA sang 1 ống Eppendorf khác (không để đầu ống chạm vào kết tủa protein ở đáy ống tránh gây nhiễu chéo DNA với kết tủa).
Thêm 300μl Isopropanol. Trộn nhẹ dung dịch bằng đảo đầu cho tới khi xuất hiện sợi kết tủa DNA trắng có thể nhìn thấy. Ly tâm 14.000 xg trong 1 phút, có thể thấy hạt DNA kết tủa trắng ở đáy ống.
Gạn bỏ dung dịch lớp trên, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống. Thêm 300μl cồn 70% ethanol ở nhiệt độ phòng. Đảo nhẹ ống vài lần để rửa kết tủa. Ly tâm 14.000 xg trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Gạn bỏ dung dịch, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống. Đặt ống trên giấy thấm và làm khơ ở nhiệt độ phịng qua đêm.
Thêm 100μl dung dịch DNA Rehydration Solution vào ống. Ủ qua đêm ở 4oC hoặc ở nhiệt độ phòng. Bảo quản ở - 20oC hoặc - 80oC.
Lấy 2μl sản phẩm DNA tách chiết để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang OD bằng máy NanoDrop 1000 (Thermo).
Quy trình tiến hành theo hướng dẫn sử dụng của máy.