Mồi Trình tự
F 5’-TGC TGT TGG AAG GTG CAA GAT-3’
Rw 5’-GCG TGA TGA TGA AAT CGG-3’
Rm 5’-GCG TGA TGA TGA AAT CGA-3’
Bước 2: Đem điện di, nhuộm ethium bromid và chụp hình ảnh sản phẩm
sau khi ARMS - PCR
Bước 3: Nhận định kiểu gen từ sản phẩm
1. Kiểu gen CC: Chỉ xuất hiện băng ở giếng thứ 1 2. Kiểu gen CT: Khi xuất hiện băng ở cả hai giếng 3. Kiểu gen TT: Chỉ xuất hiện băng ở giếng thứ 2
Bước 4: Giải trình tự một số mẫu ngẫu nhiên với 3 kiểu gen tương ứng CC,
CT và TT để kiểm định độ chính xác của kĩ thuật ARMS - PCR.
2.4.4.2. Phương pháp RFLP-PCR trong xác định SNP rs41494349 của LRP5 và rs11211980 của FTO
Bước 1: Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen chứa đa hình
- Thành phần và lượng cho phản ứng thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) PCR Master mix 2X 10 F (4µM) 2 R (4µM) 2 DNA 2 Nuclease-free water 4 Tổng lượng 20 rs41494349: 95°C-2m;35*(95°C-15s;58°C-30s;60°C-1m);68°C-8m rs11211980: 95°C-2m;35*(95°C-15s;56°C-30s;72°C-30s);72°C-10m
Bảng 2.9. Trình tự chuỗi DNA mồi
Mồi Trình tự rs41494349 của LRP5 F 5′-CTCTGGGCATAGTGCTCCATC-3′ R 5′-CCGGAGATGACCACGTTCTG-3 rs11211980 của FTO F 5’-TCTATCCTGCATGTAATGAG-3’ R 5’-GTCACGTGTCTTGGTACCAT-3’
Bước 2: Điện di sản phẩm kiểm tra kết quả phản ứng PCR bằng phương
pháp điện di. Lấy 5µl sản phẩm phản ứng PCR được điện di ở 100V trên thạch agarose 2,5%, sử dụng đệm TBE 0,5X. Băng sản phẩm được nhuộm Red safe và chụp bằng máy Gel Doc. Sản phẩm PCR với kích thước xác định sau điện di có băng rõ nét sẽ được sử dụng để ủ enzyme.
Bảng 2.10. Thời gian điện di, kích thước sản phẩm theo phương pháp RFLP-PCR
SNP Thời gian điện di Kích thước sản phẩm
rs41494349 của LRP5 30 phút 308 bp
Bước 3: Ủ sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn đặc hiệu Những mẫu
PCR có băng rõ nét sẽ được ủ với enzyme giới hạn từ 5 - 10 µl tùy theo mức độ rõ nét của sản phẩm. Thành phần của hỗn hợp phản ứng, nhiệt độ và thời gian ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất