Tách DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đơn phân lập được
DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đƣợc tách chiết và tinh sạch theo Zhou và cs (1996). Cụ thể:
Bƣớc 1: Nuôi lắc tế bào qua đêm trong môi trƣờng LB ở 30oC. Sau đó thu sinh khối bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch, thu sinh khối và rửa lớp polysaccharide của tế bào vi khuẩn bằng đệm NaPP, (pH 8).
Bƣớc 2: Bổ sung 540 µl Extration buffer và Vortex kỹ. Bƣớc 3: Bổ sung 5 µl Protease K (20 mg/ml), ủ lắc ở 37o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bƣớc 4: Bổ sung 60 µl SDS 20% rồi ủ 65o
C trong 2h.
Bƣớc 5: Bổ sung 600 µl C:I (24:1), ly tâm 1200 vòng/phút trong 15 phút. Hút pha trên. Lặp lại 2 lần.
Bƣớc 6: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ thể tích gấp 6 lần tổng dịch chiết, ủ lạnh trong 1 giờ.
Bƣớc 7: Ly tâm 1200 vòng/phút ở 15 phút, 4oC. Loại dịch, thu tủa.
Bƣớc 8: Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm lại 1200 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi.
Bƣớc 9: Để khô mẫu, hòa tan tủa bằng 25 µl nƣớc.
Nhân đoạn gen 16s rRNA của các chủng phân lập được
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp, do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn.
PCR là kỹ thuật đòi hỏi độ chính xác cao, do đó để đảm bảo cho phản ứng này thành công thì các thành phần trong phản ứng phải đảm bảo chính xác về nồng độ.
Cặp mồi 341f (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) [33] và 907r (5’- CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’) [32] đƣợc sử dụng để nhân đoạn gen 16S rRNA với kích thƣớc khoảng 500 bp của các chủng vi khuẩn. Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl nhƣ sau:
Bảng 2.2. Các thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nƣớc khử ion 14,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 dNTPs (25 mM) 2 4 MgCl2 (25 mM) 2,5 5 Mồi 341f (10 µM) Mồi 907r (10 µM) 1 6 DNA khuôn (10 ng/µl) 1
7 Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,5
Tổng thể tích 25
Hình 2.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc nhân lên đúng kích thƣớc, sẽ đƣợc tinh sạch và gửi đi đọc trình tự trên máy xác định trình tự tự động.
Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
DNA đƣợc lựa chọn mang đoạn gen mong muốn đƣợc gửi xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp của Sanger. Trình tự nucleotide đƣợc xử lý bằng phần mềm Bioedit và so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen thế giới (NCBI).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tiến hành so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn thu đƣợc với đoạn gen có kích thƣớc và vị trí tƣơng tự ở các chủng đã công bố trong ngân hàng gen thế giới NCBI (sử dụng chƣơng trình Blast để so sánh độ tƣơng đồng) và dữ liệu các chủng vi khuẩn trên LPSN (list of prokaryotic names with standing in nomenclature – danh mục tên các vi sinh vật nhân sơ). Sử dụng phẩn mềm Bioedit, Clustal X và Mega 4 để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành
Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn đƣợc trong 50 ml môi trƣờng HKTS dịch ở các giá trị pH lần lƣợt là 6, 7, 8, 9 và 10 ở 30o
C. Cứ sau 24 giờ, lấy 1ml dung dịch nuôi và kiểm tra mật độ quang phổ tại bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sử dụng điều kiện tối ƣu ở trên, tiến hành nuôi cấy các chủng nghiên cứu trong 50 ml môi trƣờng HKTS dịch, pH 7, nghiên cứu ở các dải nhiệt độ là 25o
C, 30oC, 37oC, 40oC, 45oC, 50oC trong vòng 7 ngày. Cứ sau 24 giờ, lấy 1ml dung dịch nuôi và kiểm tra mật độ quang phổ tại bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
Ảnh hưởng của nguồn carbon
Sử dụng các điều kiện pH, nhiệt độ tối ƣu ở trên, nuôi cấy các chủng trên các nguồn đƣờng khác nhau: glucose, saccharose, mantose, lactose ở 30oC và bổ sung. Sau mỗi 24 giờ, lấy 1 ml dịch nuôi và kiểm tra mật độ quang phổ tại bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
Ảnh hưởng của nguồn nitor
Tiến hành nuôi cấy các chủng trên nguồn đƣờng saccharose cùng với 4 nguồn nitor khác nhau: KNO3, NaNO3, cao men và peptone ở các điều kiện tối ƣu ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trên về pH, nhiệt độ, nguồn carbon. Cứ sau 24 giờ lấy 1 ml dịch nuôi để kiểm tra OD ở bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
2.2.7. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo thành ở điều kiện tối ưu thành ở điều kiện tối ưu
Để đánh giá khả năng sử dụng phenol của một số chủng có khả năng tạo màng, chúng tôi tiến hành cấy sinh khối các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng khoáng Gost thạch có bổ sung cơ chất phenol. Sau 5 đến 7 ngày, dùng que cấy tròn, lấy sinh khối cho vào bình môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung sẵn 50, 100, 150 và 200 ppm phenol và điều chỉnh giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm đạt 0,3. Sau 24 giờ nuôi cấy, hút 1ml dịch ra để tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600 nm trong vòng 7 ngày với mỗi thí nghiệm đo OD lặp lại 3 lần. Sau đó lập đƣờng cong sinh trƣởng để đánh giá khả năng phân hủy phenol tại nồng độ mà màng sinh học đa chủng sinh trƣởng và phát triển tốt nhất.
Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học tạo thành từ 3 chủng vi khuẩn
ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi tĩnh trên môi trƣờng HKTS lỏng để tạo màng sinh học. Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó bổ sung môi trƣờng khoáng Gost dịch và 150 ppm phenol. Sau 7 ngày nuôi tĩnh, dịch nuôi cấy đƣợc phân tích để xác định hàm lƣợng phenol còn lại bằng đánh giá khả năng phân hủy phenol bằng phƣơng pháp đo quang.
Khả năng phân hủy phenol đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp đo quang. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện theo nguyên lý: trong môi trƣờng kiềm phenol kết hợp với 4-aminotipyrine để tạo ra một phức antypyrine màu nâu đỏ, ổn định, cƣờng độ màu tỉ lệ với hàm lƣợng phenol trong mẫu. Độ hấp phụ cực đại của màu này đƣợc xác định ở bƣớc sóng 510 nm. Dịch nuôi cấy đƣợc điều chỉnh pH<4 bằng dung dịch H3PO4. Các chất oxi hóa nhƣ chlorine trong mẫu đƣợc phát hiện bởi iot tự do đƣợc giải phóng ra quá trình oxi hóa mẫu trong sự có mặt của KI. Khi đó Cl-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sẽ bị loại bỏ ngay lập tức sau khi thêm một lƣợng sắt (II) amoni sulfate vào mẫu. Mẫu đƣợc chƣng cất và điều chỉnh pH lên 10 bằng dung dịch đệm chứa NH4Cl, NH4OH và bổ sung dung dịch aminotipyrine và dung dịch K3Fe(OH)6 cho tới khi mẫu lên màu nâu đỏ thì tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 510 nm. Dựa vào nồng độ phenol của dung dịch chuẩn tiến hành dựng đƣờng chuẩn và từ đó tính đƣợc nồng độ phenol có trong mẫu.
Kết quả phân hủy phenol đƣợc gửi phân tích ở Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu thập mẫu và phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol
3.1.1. Thu thập mẫu
Mẫu đƣợc lấy từ các địa điểm ô nhiễm khác nhau của bể chứa kho xăng dầu Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội, mẫu có màu đen, nhiều váng, mùi hắc khó chịu.
3.1.2. Phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol
Phân huỷ sinh học phenol diễn ra theo 2 cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất. Trên thế giới đã có 1 số công trình nghiên cứu về khả năng phân huỷ phenol của các chủng vi sinh vật theo cơ chế đồng trao đổi chất. Trong nhiều trƣờng hợp, bổ sung nguồn carbon thứ 2 giúp chúng khởi động quá trình sinh trƣởng, phát triển và tăng cƣờng khả năng phân huỷ chất độc. Do đó từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng phenol đƣợc phân lập theo phƣơng pháp làm giàu trên môi trƣờng muối khoáng chứa 50 ppm phenol (có và không bổ sung glucose với nồng độ 0,1%).
Sau 3 lần làm giàu, chúng tôi nhận thấy màu sắc và độ đục của môi trƣờng thay đổi so với nguồn mẫu nƣớc thải ban đầu, sinh khối ngày càng tăng lên, điều đó
A B
Hình 3.1. Mẫu nƣớc (A) và mẫu bùn (B) thu thập đƣợc từ bể chứa nƣớc thải kho xăng dầu Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cho thấy phần nào sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật trong mẫu nƣớc thải. Điểm khác biệt là dịch làm giàu có bổ sung glucose thì độ đục dịch nuôi cũng nhƣ sinh khối bám trên thành bình nhiều hơn so với dịch làm giàu không bổ sung glucose tƣơng ứng, chứng tỏ việc bổ sung nguồn carbon thứ hai giúp cho các chủng vi sinh vật ở đây phát triển mạnh hơn. Điều này cũng phù hợp với khả năng phát triển các chủng vi sinh vật có trong nƣớc thải. Kết quả đƣợc thể thiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Mẫu làm giàu vsv trên môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol
Sau khi tiến hành làm giàu lần 3, các mẫu đƣợc pha loãng tới hạn rồi cấy gạt trên môi trƣờng khoáng Gost thạch có bổ sung 50 ppm phenol. Sau 2 ngày trên đĩa thạch xuất hiện các loại khuẩn lạc với các hình dạng khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Có glucose Không có glucose
Hình 3.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng Gost thạch (có và không bổ sung glucose) với 50 ppm phenol sau 3 lần làm giàu
Sau khi đã tiến hành làm sạch và quan sát khuẩn lạc, có 8 chủng vi khuẩn đƣợc phân lập. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng phân hủy phenol của từng chủng. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng khoáng Gost có bổ sung 50 ppm phenol (có và không bổ sung glucose), lắc ở nhiệt độ 30oC trong 7 ngày. Khả năng phân hủy phenol đƣợc đánh giá định tính thông qua quan sát độ đục của môi trƣờng và giá trị đo OD ở bƣớc sóng 600 nm. Kết quả đƣợc chỉ ra ở hình 3.4.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1 2 3 4 5 6 7 OD 600nm Ngày ĐGP1 ĐGP3 ĐGP5 ĐGP6 ĐGP7 ĐGP8 ĐGP2 ĐGP4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn
Từ đồ thị trên, chúng ta thấy các chủng ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8 sinh trƣởng và phát triển tốt hơn các chủng còn lại và sinh trƣởng phát triển mạnh nhất từ ngày thứ 3 tới ngày thứ 4. Với mục tiêu là phân lập và tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn vừa có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt trên nguồn cơ chất phenol, vừa sàng lọc đƣợc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt, các chủng vi khuẩn này đƣợc chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tạo màng sinh học của chúng.
3.1.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt
Để đánh giá khả năng tạo màng, chúng tôi tiến hành nhuộm tế bào với tím tinh thể theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006). Phƣơng pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong một biofilm trên bề mặt giá thể, đồng thời cũng cho phép định lƣợng mức độ hình thành biofilm mạnh hay yếu trong một khoảng thởi gian nhất định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 570 nm. Giá trị đo OD tại bƣớc sóng 570 nm càng cao chúng tỏ mật độ tế bào trong biofilm càng cao và ngƣợc lại. Khả năng bắt màu tím tinh thể của 8 chủng vi khuẩn đƣợc thể hiện ở hình 3.5 và hình 3.6.
Hình 3.5. Khả năng tạo biofilm của 8 chủng vi khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. Khả năng tạo màng của 8 chủng vi khuẩn
Quan sát hình 3.5 và hình 3.6 chúng tôi nhận thấy có 4 chủng có khả năng tạo màng tốt nhất là ĐGP2, ĐGP4, ĐGP6 và ĐGP8. Kết hợp với kết quả đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ở trên, chúng tôi đã lựa chọn 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu
Từ 3 chủng vi khuẩn ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8, chúng tôi tiến hành quan sát các đặc điểm khuẩn lạc. Hình thái tế bào của 3 chủng đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét SEM-S4800. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng vi khuẩn
Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Đặc điểm khuẩn lạc, tế bào Đ G P 2 - Khuẩn lạc tròn, màu trắng, trong, bóng, ƣớt, đƣờng kính 1,5- 2 mm.
- Tế bào hình que, hai
0 5 10 15 20 25 30 35 ĐGP1 ĐGP2 ĐGP3 ĐGP4 ĐGP5 ĐGP6 ĐGP7 ĐGP8 OD 570 nm 24h 48h 72h Chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đầu tù, có tiên mao, kích thƣớc (0,3 – 0,4) x (0,8- 1,2) µm Đ G P 4 - Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, lồi, bề mặt ƣớt, đƣờng kính 1-1,5 mm. - Tế bào hình que, kích thƣớc (0,3 – 0,45) x (1,2-2) µm Đ G P 8 - Khuẩn lạc tròn, trắng, trong, đƣờng kính 1,5 – 2 mm - Tế bào hình que, kích thƣớc (0,3-0,5) x (0,8 – 1,2) µm
3.2. Phân loại và định tên 3 chủng tạo biofilm tốt
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Trong phân loại phân tử, việc tách chiết DNA tổng số đƣợc nguyên vẹn, không đứt gãy, không lẫn tạp các thành phần khác nhƣ protein, polysaccharide, RNA là rất quan trọng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số theo Zhou và cộng sự. Sản phẩm sau đƣợc điện di trên gel agarose 1%, sau đó nhuộm bằng ethidium bromide. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7. Hình ảnh điện di DNA tổng số 3 chủng vi khuẩn
A: ĐGPG2; B: ĐGPG4; C: ĐGPG8
Kết quả điện di cho thấy DNA tổng số từ 3 chủng sạch, hàm lƣợng đủ lớn, băng gọn, không bị đứt gãy và đủ chất lƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
DNA tổng số của các chủng sau khi đƣợc tách chiết ở trên đƣợc chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi 341f và 907r. Kết quả thu đƣợc sau khi điện di nhƣ hình 3.8.
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ kết quả sản phẩm nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA, chúng tôi thấy sản phẩm PCR 3 chủng có kích thƣớc khoảng 500 bp. Điều này hoàn toàn phù hợp với các tính toán lý thuyết. Sản phẩm PCR của 3 chủng này đƣợc tinh sạch và gửi đọc trình tự trên máy xác định trình tự tự động.