Tiến hành theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1988); Morikawa và cộng sự (2006). Quy trình nhƣ sau:
Làm tƣơi mới chủng giống:
Nguyên lý:
Sau khi phân lập và tuyển chọn, các chủng giống đã đƣợc bảo quản ở tủ lạnh 4oC. Do đó, để tiến hành các bƣớc tiếp theo, cần hoạt hoá làm tƣơi mới chủng giống bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trƣờng giàu chất dinh dƣỡng trong 16 giờ, tạo điều kiện cho chúng sinh trƣởng và phát triển tốt.
Tiến hành:
Cấy các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng HKTS dịch. Sau 14-16 giờ nuôi cấy, đem ly tâm, loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4000 vòng/phút, 4o
C trong vòng 10 phút và rửa nƣớc cất 2 lần với thể tích tƣơng ứng). Bổ sung nƣớc cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nƣớc cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào eppendorf chứa 297 µm môi trƣờng LB. Làm thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu đƣợc nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofiml sau 24, 48 và 72 giờ.
Kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch acid acetic 33% sau
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhuộm có tác dụng loại bỏ tím kết tinh ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, các tím kết tinh sẽ đƣợc giải phóng và hoà tan trong dung môi. Giá trị OD ở bƣớc sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lƣợng tím tinh thể đƣợc cố định, tức đặc trƣng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay chính là khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tƣơng ứng.
Tiến hành:
- Cứ sau 24 giờ, lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tƣơng ứng với 3 eppendorf ra ngoài (không làm vỡ màng).
- Rửa nhẹ màng sinh học bằng 500 µl nƣớc cất rồi hút ra lặp lại lần nữa.
- Cho 300 µl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf.
- Đợi 10 phút để cố định, ở nhiệt độ phòng.
- Hút bỏ dung dịch tím tinh thể
- Rửa 2 lần bằng 500 µl nƣớc cất.
- Bổ sung 300 µl dung dịch acid acetic 33%.
- Đảo trộn hỗn hợp, pha loãng tới hạn rồi đo OD ở bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.