kiện tối ưu
Để đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm từ các chủng tuyển chọn, chúng tôi tiến hành nuôi tĩnh hỗn hợp các chủng đã chọn lọc trên môi trƣờng HKTS 50 ml để tạo màng. Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó bổ sung môi trƣờng khoáng dịch và phenol ở các nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm và 200 ppm. Đem nuôi tĩnh ở 30o
C, mẫu dịch tế bào đƣợc chiết rút sau mỗi 24 giờ để phân tích, xử lý. Sau 7 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện qua hình 3.14. 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h Saccarose + Natri Saccarose + Kali Saccarose + Cao men Saccarose + pepton OD 570 nm BDGP2 BDGP4 BDGP8
NaNO3 KNO3 Cao men Pepton Nguồn nitor
ĐGP2 ĐGP4 ĐGP8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau
Từ hình 3.14 chúng tôi nhận thấy, sau 7 ngày thí nghiệm tại nồng độ phenol 150 ppm, khả năng chuyển hóa phenol là tốt nhất, theo đó mẫu thí nghiệm này đƣợc phân tích định lƣợng bằng phƣơng pháp đo quang.
Để đánh giá khả năng phân hủy phenol do 3 chủng vi khuẩn tạo thành, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng phenol trƣớc và sau thí nghiệm bằng phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn. Dựa trên đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với các nồng độ phenol khác nhau, chúng tôi nhận thấy, sau 7 ngày xử lý, hàm lƣợng phenol còn lại trong mẫu thí nghiệm là 1,034 mg/l và trong mẫu đối chứng là 148,7 mg/l. Từ đó, chúng tôi tính toán đƣợc hiệu suất phân hủy phenol do màng sinh học đa chủng tạo thành là 99,3% và mẫu đối chứng là 0,87%. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 1 2 3 4 5 6 7 OD 600 nm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm Ngày
47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý
Hiện nay, các công bố về khả năng phân hủy phenol của màng sinh học đa chủng ở trong nƣớc và trên thế giới còn hạn chế, các nghiên cứu về phân hủy phenol chỉ tập trung ở các chủng đơn lẻ hoặc các chủng vi sinh vật đƣợc cố định trên các vật liệu mang khác nhau. Năm 2009, Thomas và Leter đã phân lập đƣợc chủng Pseudomonas sp. từ lớp đất mặt của nhà máy sản xuất khí gas có khả năng phân hủy một hỗn hợp các chất bao gồm cresol, phenol, dimethylphenol và trimethylphenol trong đó hiệu suất phân hủy phenol lên đến 99%. Cũng trong năm 2009, Lin và cộng sự đã phân lập Pseudomonas fluorescens từ nƣớc thải công nghiệp có khả năng phân hủy 85,4% phenol từ 32g/l ban đầu (có bổ sung 1% glucose). Năm 2012, Cheng và cộng sự đã chỉ ra khả năng phân hủy phenol từ
chủng Ochorobactrum sp. CH10 có khả năng phân hủy phenol ở các nồng độ 400
ppm, 900 ppm, 1000 ppm trong 24, 44, 48 giờ với hiệu suất phân hủy tƣơng ứng là 100%, 92,3%, 82,2% (ở điều kiện pH 7, nhiệt độ 30oC). Năm 2010, Cung Thị Ngọc Mai và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng BTL11 từ nƣớc thải khu công nghiệp có khả năng phân hủy 100 ppm phenol với hiệu suất 99% sau 14 ngày xử lý (có bổ sung 0,5% glucose). Năm 2013, Lê Thị Nhi Công và đồng tác giả đã phân lập đƣợc 4 chủng vi khuẩn B2, B8, B15 và B16 vừa tạo màng tốt, vừa phân hủy phenol cao.
0.87 99.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Đối chứng Thí nghiệm Hiệu suất ph ân hủ y (% ) Đối chứng Thí nghiệm 0,87 99,3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Màng sinh học do 4 chủng vi khuẩn này tạo thành có khả năng chuyển hóa 99% phenol sau 7 ngày xử lý với nồng độ ban đầu 150 ppm.
Nhƣ vậy, so với các công trình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam thì màng sinh học đa chủng do 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 tạo thành trong đề tài của chúng tôi vừa tạo màng tốt, vừa phân hủy phenol cao. Do đó, có thể ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong việc xử lý phenol và các dẫn xuất khác của phenol gây ô nhiễm môi trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ mẫu nƣớc thải bể chứa kho xăng dầu Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội phân lập
đƣợc 8 chủng vi khuẩn trên nguồn cơ chất phenol, trong đó 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 có khả năng sinh trƣởng và phát triển và tạo màng sinh học tốt nhất.
2. Các chủng ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8 đƣợc định danh lần lƣợt là Ochrobactrum sp.
DGP2, Pseudomonas sp. DGP4 và Pseudomonas sp. DGP8. Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của 3 chủng đã đƣợc đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế với mã số lần lƣợt là KJ700308, KJ748401 và KJ700307.
3. Các chủng vi khuẩn ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 sinh trƣởng và phát triển tốt nhất trong 48 giờ, ở pH 7, nhiệt độ 30oC, nguồn carbon là saccharose và nguồn nitor là KNO3.
4. Màng sinh học do 3 chủng ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8 tạo thành có khả năng phân hủy
99,3% nồng độ phenol ban đầu là 150 ppm sau 7 ngày nuôi cấy.
Kiến nghị
Mở rộng nghiên cứu khả năng phân hủy phenol của màng sinh học đa chủng ở quy mô lớn hơn để có thể áp dụng vào thực tiễn để xử lý môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm phenol và các nguồn ô nhiễm tƣơng tự.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Tô Kim Anh (2004), “Nghiên cứu giải pháp sinh học phân giải phenol và một số dẫn xuất của phenol”, Báo cáo đề tài nhánh cấp Nhà nước KC-04.
2. Lê Thị Nhi Công, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (2012), “Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học của chủng Rhodococcus sp. B2 phân lập từ kho xăng Đỗ Xá, Hà Nội”, Tạp chí Công nghệ sinh học 10(3): 563-569.
3. Trần Thuý Hằng (2011), Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học phân lập ở Việt Nam. Luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Trƣơng Thế Kỷ, Hoá hữu cơ 1: Hợp chất hữu cơ đơn chức và đa chức, Nhà xuất bản Y học.
5. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Hải Đăng, Nguyễn Văn Bắc và cộng sự (2010), “Nghiên cứu khả năng phân huỷ hydrocarbon thơm đa nhân và phenol của chủng vi khuẩn BTL11 phân lập từ nƣớc thải khu công nghiệp”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học khu vực Miền trung và Tây Nguyên: 1739-1744.
6. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Thị Khánh Vân, Nghiêm Ngọc Minh (2010), “Hình
thái tế bào và khả năng phân hủy PAH và phenol của chủng vi khuẩn BTL6 phân lập từ nƣớc thải khu công nghiệp”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 68(6): 101-106.
Tiếng Anh
7. Andersson S, Dalhammar G, Lan CJ, Kuttuva Rajarao G (2009),
“Characterization of extracellular polymeric substances from denitrifying organism Comamonas denitrificans”, Appl Microbiol Biotechnol 82(3):535-43.
8. Bidleman T, Walla M, Roura R, Carr E, Schmidt S (1993), “Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January- March, 1990”, Mar Pollut Bull 26(5): 258- 262.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
9. Bruce RM, Santodonato J, Neal MW (1987), “Summary review of the health effects associated with phenol”, Toxicol indust Health 3(4): 535-68.
10. Cerniglia CE (1992), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocacbons”, Current Opinion in Biotechnology 3: 331-368.
11. Cheng KC, Demicri A and Catchmark JM (2010), “Adances in biofilm reactors for production of value – added products”, Appl Microbiol Biotechnol 87(2): 445-456.
12. Costerton JW, Ingram JM, Cheng KJ (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriol Rev 38(1): 87-110.
13. Davey ME, O’Toole GA (2000), “Microbial biofilm: from ecology to moclecular genetics”, Microbiol Mol Biol Rev 64(4): 847-867.
14. Donlan RM (2012), “Biofilm: microbial life on surfaces”, Emerg Infect Dis
8(9): 881-890.
15. Donlan RM, Pipes WO, Yohe TL (1994), “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research 28(6): 1497-1503.
16. Ghadi S and Sangodkar UMX (1994), “Identification of a meta-cleavage pathway for metabolism of phenoxyacetic acid and phenol in Pseudomonas cepacia AC1100”, Biochem Biophys Res Commun 204(2): 983-993.
17. García-Martínez J, Acinas SG, Antón AI, Rodríguez-Valera F (1999), “Use of 16S-23S sibosomal gens spacer region in studies of prokaryotic diversity”, J Microbiol Methods 36(1-2): 55-64.
18. Jones AL, Brown JM, Mishara V, Perry JD, Steigerwalt AG, Goodfellow M (2004), “Rhodococcus gordiniae sp. Nov, an actinomycete isolate from clinical material and phenolcontaminate soil”, Int J Syst Evol Microbiol 54(2): 407- 411
19. Kästner M, Breuer-Jammali M, Mahro B (1998), “Impact of innoculation protocols, salinity anh pH on the degradation of polycyclic aromatic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hydrocacbons (PAH) and survival of PAH – degrading bacteria introduced into soil”, Appl Environ Microbiol 64(1): 359 – 362.
20. Katayama-Hirayama K, Tobita S and Hirayama K (1991), “Metabolic pathway of phenol in Rhodotorula rubra”, J Gen Appl Microbiol 37(4): 379-388.
21. Koboyashi H and Rittman B E (1982) “Microbial removal of hazardous organic compounds’’, Environ Sci Technol 16(3): 170-183.
22. Komacova E, Paca J, Klapkova E (2003), “Phisiological changes of Candida tropicalis population degrading phenol in fed batch reactor”, Braz Arch Biol Technol 46(4): 375-421.
23. Lack A and Fuchs G (1992), “Carboxylation of phenyl phosphate by phenol carboxylase, an enzyme system of anaerobic phenol metabolism”, J Bacteriol
174(11): 3629-3636.
24. Lack A and Fuchs G (1994) “Evidence that phenol phosphorylation to phenol phosphate is the first step in anaerobic phenol metabolism in a denitritying
Pseudomonas sp”, Arch Microbiol 161(2): 132-139.
25. Laine M, Jorgensen K (1996), “Straw compost and bioremediated soil as inocula for the bioremedation of chlorophenol contaminated soil”, Appl Environ Microbiol 62(5): 1507-1513.
26. Lazarova V, Manem J (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for waste and waste water treatment”, In Biofilm II: process analysis and application, Bryers JD, Editor.Wiley-Liss: New York:159-206.
27. Leonard, D and Lindley ND (1998), “Carbon and energy flux constraints in continuous cultures of Alcaligenes eutrophus grown on phenol”, Microbiol
144(1): 241-248.
28. Lin J, Moorthi V, Qoma BE (2008), “Bacterial removal of toxic phenols from industrial effluent”, Afr J Biotechnol 7(13): 2232-2238.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
29. Liu YJ, Kuschk P, Zhang AN, Wang XC (2009), “Characterisation of phenol degradation by Acinetobacter sp. XA05 and Sphingomonas sp. FG03”, Chem Ecol 25(2): 107-117.
30. Marc R, James U (2005), “Rhodococcus phenolicus sp. nov., a novel bioprocessor isolated actinomycete with the ability to degrade chlorobenzene, dichlorobenzene and phenol as sole cacbon sources”, Syst Appl Microbio 28(8): 695-701.
31. Munnazza AJAZ, Nabeela Noor, Sheikh AJAZ R, Shakeel A.khan (2004), “Phenol resistant Bacteria from soil: Identification – Characterization and genetical studies”, Park J Bot 36(2): 415-424.
32. Muyzer G, Brinkhoff T, Nu¨ bel U (1998), Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In: Akkermans ADL, van Elsas JD, de Bruijn FJ (eds), Molecular Microbial Ecology Manual: 1–27
33. Muyzer G, De Waal EC, Uitterlinden AG (1993),“Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA”, Appl Environ Microbiol 59(3): 695–700.
34. Nair CI, Jayachandran K, Shashidhar S (2008), “Biodegradation of phenol”, Afr J Biotechnol 7(25): 4951-4958.
35. National Research Council (1993), “Insitu Bioremediation: When does it Work?”,National Academy Press, Washington DC 1(3): 38-42.
36. Paller G, Hommel RK and Kleber HP (1995), “Phenol degradation by
Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250”, J Basic Microbiol 35(5): 325 -335.
37. Prieto MB, Hidalgo A, Rodríguez-Fernández C (2002), “Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis
UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier”, Appl Microbiol Biotechnol 58(6): 853-859.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
38. Rehfuss M, Urban J(2005), “Rhodococcus phenolicus sp. nov,a novel bioprocessor isolated actinomycete with the ability to degrade chlorobenzene, dichlorobenzene and phenol as sole carbon sources”, Syst Appl Microbio 28(8): 695-701
39. Sambrook J, Russell DW (2001), “Molecular clonning”, A laboratory manual, 3rd ed. Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork.
40. Singh S, Singh BB, Chandra R(2009), “Biodegradation of phenol in Batch Culture by Pure and Mixed Strains of Paenibacillus sp. and Bacillus cereus”, Pol J Microbiol 58(4): 319-325.
41. Swarts JH, Verhagen JMF, Field AJ (1998), “Trichlorinated phenols from hypholoma elongatum”, Phytochemistry 49(3): 203-206.
42. Talley JW and Sleeper PM (1997), “Roadblock to the implementation of biotreatment strategies”, Ann N Y Acad Sci 829(21): 16-29.
43. Tarek AT, Kassim A, Bernd RT (2001), “Microbial transformations at aqueous- solid phase”, The Handbook of Environmental Chemistry 5(E): 315-425.
44. Thomas AO, Lester JN (1993), “Degradation of phenol using bacteria isolated from the subsurface of manufactured gas plants”, Hazard waste hazard 10(4): 413-430.
45. Todorovic V (2003), “Acute phenol poisoning”, Med Pregl 56(1): 37-41.
46. USPA 1980, Ambient water quality criteria for phenol. EPA-440/5-80-066. USPA, Criteria anh standards Division, Washington, DC.
Tài liệu internet
47. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dan-so-tai-nguyen-va-moi truong.189616.html
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN
PGS.TS. NGHIÊM NGỌC MINH
XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG