Hiện nay, các phƣơng pháp phân loại hiện đại thƣờng dựa trên việc đánh giá mức phân tử acid nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp khác nhau để tiến hành phân loại. Trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, ngƣời ta sử dụng một phƣơng pháp nghiên cứu mới cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”. Phƣơng pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao.
Trƣớc đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác. Với việc phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử nucleic acid (DNA, RNA). Các phƣơng pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Trong đó, việc nghiên cứu phân tử rRNA đƣợc coi là phƣơng pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao. Trong 3 loại rRNA của vi khuẩn (5S 16S và 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Vì gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thƣớc khoảng 120 nuceotide, dễ đọc và so sánh trình tự nhƣng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng. Còn gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thƣớc lớn (3000 nucleotide), do đó gây khó khăn cho việc đọc và so sánh trình tự. Chỉ có gen 16S rRNA với kích thƣớc khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết trình tự gen giữa các chủng vi khuẩn, vừa không gây khó khăn cho việc đọc và so sánh do kích thƣớc vừa phải. Bởi vậy, gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu và thiết lập rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn [17].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nƣớc đƣợc lấy từ bể chứa nƣớc thải của kho xăng dầu Đức Giang - Gia Lâm - Hà Nội. Sau đó, đƣợc lƣu giữ tại phòng Công nghệ sinh học môi trƣờng - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
2.1.2. Hoá chất, môi trường
Hoá chất: các hoá chất đƣợc sử dụng đều là các hoá chất ngoại nhập của các
hãng: Sigma, Merk, Biobasic…
Môi trƣờng nuôi cấy: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu đƣợc chỉ ra ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng để phân lập và đánh giá khả năng phân hủy phenol của các chủng vi khuẩn
Môi trường khoáng Gost dịch Môi trường khoáng Gost thạch
KNO3 : 3g KH2PO4 : 0,3g MgSO4 : 0,4g NaH2PO4 :0,4g NaCl : 1g Nƣớc máy vừa đủ 1lít Các thành phần giống nhƣ môi trƣờng Gost dịch nhƣng có bổ sung thêm 18 - 20g agar, nƣớc máy vừa đủ 1 lít.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Môi trường LB dịch Môi trường LB thạch
NaCl : 10g Cao men : 5g Tryptone : 10g pH : 7-7,2 Nƣớc máy vừa đủ 1 lít Các thành phần giống nhƣ LB dịch, nhƣng bổ sung thêm 18 - 20g agar, nƣớc máy vừa đủ 1 lít.
Môi trƣờng thử khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
Môi trường hiếu khí tổng số dịch Môi trường hiếu khí tổng số thạch
Pepton : 5g Cao thịt : 3g Glucose : 1g NaCl : 1g Nƣớc cất : 1lít pH : 7-7,2 Các thành phần giống nhƣ môi trƣờng Gost dịch nhƣng có bổ sung thêm 18 - 20g agar, nƣớc cất vừa đủ 1 lít.
Nước muối sinh lý (0,85%)
NaCl : 8,5g
Nƣớc cất vừa đủ 1 lít
Thành phần các môi trƣờng đƣợc cân cẩn thận và đƣợc khử trùng ở 121o
C trong 30 phút. Riêng với môi trƣờng HKTS và LB đƣợc khử trùng ở 115o
C.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các máy móc thiết bị đƣợc sử dụng trong quá trình nghiên cứu có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trƣờng – Viện Công nghệ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sinh học Việt Nam bao gồm: Kính hiển vi, cân kỹ thuật, tủ sấy, tủ cấy vô trùng, tủ nuôi ổn nhiệt, máy li tâm eppendorf, máy nuôi lắc, máy PCR, máy soi DNA, máy đo OD, máy điện di, bàn soi tia UV, tủ lạnh, lò vi sóng, đầu côn, pipetman, ống ly tâm, ...
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập mẫu
Nguyên tắc:
Mẫu lấy đƣợc phải mang tính đại diện cao, hạn chế tạp nhiễm và phù hợp với mục đích nghiên cứu. Sau khi chọn đƣợc địa điểm lấy mẫu thích hợp, dùng dụng cụ lấy mẫu vào lọ nút mài (đã đƣợc khử trùng và làm khô) và chuyển về phòng thí nghiệm. Ghi đầy đủ thông tin trên bình: tên mẫu, ngày giờ, địa điểm lấy mẫu và ngƣời lấy mẫu. Mẫu lấy về đƣợc tiến hành phân tích vi sinh vật trong vòng 24 giờ để đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi.
Tiến hành:
Trƣớc khi lấy mẫu, mẫu đƣợc đảo trộn đều bằng thiết bị vô trùng. Mẫu đƣợc lấy ở 3 vị trí: tầng mặt, tầng giữa và tầng đáy đại diện cho các nhóm vi sinh vật hiếu khí, vi hiếu khí và kỵ khí. Mẫu đƣợc trộn đều lên, đƣợc lƣu giữ ở 4oC và đƣợc phân tích trong 24 giờ lấy mẫu.
2.2.2. Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trường chứa phenol
Nguyên tắc:
Tạo môi trƣờng thích hợp để làm gia tăng số lƣợng vi sinh vật từ mẫu nƣớc thải ban đầu trên nguồn cơ chất phenol.
Tiến hành:
Làm giàu vi sinh vật đƣợc tiến hành 3 lần ở nồng độ phenol 50 ppm.
Làm giàu lần 1: Hút 5 ml mẫu nƣớc thải vào bình tam giác 250 ml có chứa 50 ml môi trƣờng khoáng Gost dịch, 50 ppm phenol, 0,1% vitamin. Một bình có bổ sung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thêm 0,1% glucose và một bình không bổ sung glucose. Nuôi lắc các bình ở máy lắc 30oC với tốc độ là 200 vòng/ phút, trong vòng 7 ngày.
Làm giàu lần 2: Chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình nuôi cấy thứ 2 chứa 50 ml môi trƣờng khoáng Gost dịch, 50 ppm phenol, 0,1% vitamin. Một bình bổ sung thêm 0,1% glucose và một bình không bổ sung glucose. Nuôi lắc các bình ở máy lắc 30oC với tốc độ 200 vòng/phút, trong vòng 7 ngày.
Làm giàu lần 3: Chuyển 10% dịch làm giàu lần 2 sang bình nuôi cấy thứ 3 và thao tác tƣơng tự nhƣ làm giàu lần 2.
2.2.3. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng phenol phenol
Nguyên tắc:
- Thu đƣợc tập đoàn vi sinh vật có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa phenol.
- Tách rời các tế bào vi sinh vật.
- Nuôi cấy các tế bào trên môi trƣờng dinh dƣỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ.
- Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng đã phân lập đƣợc, tuyển chọn các chủng có khả năng phân hủy phenol tốt nhất.
Tiến hành:
- Sau khi pha loãng tới 10-8, hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào các đĩa petri chứa môi trƣờng khoáng bổ sung 50 ppm phenol.
- Dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch.
- Tiếp tục sử dụng que trang này để trải đều khắp mặt thạch ở đĩa thứ 2, thứ 3 … ở các độ pha loãng khác nhau.
- Các đĩa sau khi đƣợc cấy gạt, đƣợc bao gói cẩn thận và nuôi cấy ở tủ ấm 30oC trong 7 ngày sẽ thu đƣợc tập đoàn vi sinh vật và các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ. Đánh dấu các khuẩn lạc khác nhau dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Nuôi các khuẩn lạc trong môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol, lắc ở 30oC trong 7 ngày và chỉnh OD tại bƣớc sóng 600 nm đạt 0,3. Cứ sau 24 giờ, lấy 1 ml dịch nuôi xác định giá trị mật độ quang phổ ở bƣớc sóng 600 nm để xác định khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn trên nguồn cơ chất phenol. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học
Tiến hành theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1988); Morikawa và cộng sự (2006). Quy trình nhƣ sau:
Làm tƣơi mới chủng giống:
Nguyên lý:
Sau khi phân lập và tuyển chọn, các chủng giống đã đƣợc bảo quản ở tủ lạnh 4oC. Do đó, để tiến hành các bƣớc tiếp theo, cần hoạt hoá làm tƣơi mới chủng giống bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trƣờng giàu chất dinh dƣỡng trong 16 giờ, tạo điều kiện cho chúng sinh trƣởng và phát triển tốt.
Tiến hành:
Cấy các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng HKTS dịch. Sau 14-16 giờ nuôi cấy, đem ly tâm, loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4000 vòng/phút, 4o
C trong vòng 10 phút và rửa nƣớc cất 2 lần với thể tích tƣơng ứng). Bổ sung nƣớc cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nƣớc cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào eppendorf chứa 297 µm môi trƣờng LB. Làm thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu đƣợc nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofiml sau 24, 48 và 72 giờ.
Kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch acid acetic 33% sau
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhuộm có tác dụng loại bỏ tím kết tinh ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, các tím kết tinh sẽ đƣợc giải phóng và hoà tan trong dung môi. Giá trị OD ở bƣớc sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lƣợng tím tinh thể đƣợc cố định, tức đặc trƣng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay chính là khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tƣơng ứng.
Tiến hành:
- Cứ sau 24 giờ, lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tƣơng ứng với 3 eppendorf ra ngoài (không làm vỡ màng).
- Rửa nhẹ màng sinh học bằng 500 µl nƣớc cất rồi hút ra lặp lại lần nữa.
- Cho 300 µl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf.
- Đợi 10 phút để cố định, ở nhiệt độ phòng.
- Hút bỏ dung dịch tím tinh thể
- Rửa 2 lần bằng 500 µl nƣớc cất.
- Bổ sung 300 µl dung dịch acid acetic 33%.
- Đảo trộn hỗn hợp, pha loãng tới hạn rồi đo OD ở bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học
Tách DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đơn phân lập được
DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đƣợc tách chiết và tinh sạch theo Zhou và cs (1996). Cụ thể:
Bƣớc 1: Nuôi lắc tế bào qua đêm trong môi trƣờng LB ở 30oC. Sau đó thu sinh khối bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch, thu sinh khối và rửa lớp polysaccharide của tế bào vi khuẩn bằng đệm NaPP, (pH 8).
Bƣớc 2: Bổ sung 540 µl Extration buffer và Vortex kỹ. Bƣớc 3: Bổ sung 5 µl Protease K (20 mg/ml), ủ lắc ở 37o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bƣớc 4: Bổ sung 60 µl SDS 20% rồi ủ 65o
C trong 2h.
Bƣớc 5: Bổ sung 600 µl C:I (24:1), ly tâm 1200 vòng/phút trong 15 phút. Hút pha trên. Lặp lại 2 lần.
Bƣớc 6: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ thể tích gấp 6 lần tổng dịch chiết, ủ lạnh trong 1 giờ.
Bƣớc 7: Ly tâm 1200 vòng/phút ở 15 phút, 4oC. Loại dịch, thu tủa.
Bƣớc 8: Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm lại 1200 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi.
Bƣớc 9: Để khô mẫu, hòa tan tủa bằng 25 µl nƣớc.
Nhân đoạn gen 16s rRNA của các chủng phân lập được
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp, do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn.
PCR là kỹ thuật đòi hỏi độ chính xác cao, do đó để đảm bảo cho phản ứng này thành công thì các thành phần trong phản ứng phải đảm bảo chính xác về nồng độ.
Cặp mồi 341f (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) [33] và 907r (5’- CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’) [32] đƣợc sử dụng để nhân đoạn gen 16S rRNA với kích thƣớc khoảng 500 bp của các chủng vi khuẩn. Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl nhƣ sau:
Bảng 2.2. Các thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nƣớc khử ion 14,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 dNTPs (25 mM) 2 4 MgCl2 (25 mM) 2,5 5 Mồi 341f (10 µM) Mồi 907r (10 µM) 1 6 DNA khuôn (10 ng/µl) 1
7 Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,5
Tổng thể tích 25
Hình 2.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc nhân lên đúng kích thƣớc, sẽ đƣợc tinh sạch và gửi đi đọc trình tự trên máy xác định trình tự tự động.
Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
DNA đƣợc lựa chọn mang đoạn gen mong muốn đƣợc gửi xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp của Sanger. Trình tự nucleotide đƣợc xử lý bằng phần mềm Bioedit và so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen thế giới (NCBI).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tiến hành so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn thu đƣợc với đoạn gen có kích thƣớc và vị trí tƣơng tự ở các chủng đã công bố trong ngân hàng gen thế giới NCBI (sử dụng chƣơng trình Blast để so sánh độ tƣơng đồng) và dữ liệu các chủng vi khuẩn trên LPSN (list of prokaryotic names with standing in nomenclature – danh mục tên các vi sinh vật nhân sơ). Sử dụng phẩn mềm Bioedit, Clustal X và Mega 4 để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành
Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn đƣợc trong 50 ml môi trƣờng HKTS dịch ở các giá trị pH lần lƣợt là 6, 7, 8, 9 và 10 ở 30o
C. Cứ sau 24 giờ, lấy 1ml dung dịch nuôi và kiểm tra mật độ quang phổ tại bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sử dụng điều kiện tối ƣu ở trên, tiến hành nuôi cấy các chủng nghiên cứu trong 50 ml môi trƣờng HKTS dịch, pH 7, nghiên cứu ở các dải nhiệt độ là 25o
C, 30oC, 37oC, 40oC, 45oC, 50oC trong vòng 7 ngày. Cứ sau 24 giờ, lấy 1ml dung dịch nuôi và kiểm tra mật độ quang phổ tại bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD