2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu trong luận văn là nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu và tiến cứu. Bao gồm các bước:
- Lựa chọn bệnh nhân và người hiến theo tiêu chuẩn.
- Lấy các thông tin hành chính, chỉ số lâm sàng và chỉ số xét nghiệm trước huy động theo mẫu bệnh án nghiên cứu.
39 khối TBG
23 khối TBG từ BN
16 khối TBG từ NH 16 khối TBG đông lạnh
14 khối TBG tươi 9 khối TBG đông lạnh
- Thu nhận khối TBG: Huy động với phác đồ tiêu chuẩn G-CSF đơn độc cả nhóm người hiến và nhóm bệnh nhân. Xét nghiệm TPTTBM hàng ngày và đếm TB CD34+ ngày thứ 4. Nếu số lượng tế bào CD34+≥10TB/µl tiến hành thu nhận khối TBG với hệ thống máy tách tự động ngày thứ 5. Sau thu nhận, các khối TBG được làm các xét nghiệm: TPTTBM, đếm số lượng tế bào CD34+ sau thu nhận. Khi số lượng tế bào CD34+ đủ yêu cầu thì kết thúc thu nhận.
- 14 khối TBG tươi (Fresh stem cell products) dùng trong ghép tự thân được truyền cho các bệnh nhân sau khi kết thúc điều kiện hóa.
- 25 khối TBG dùng trong ghép tự thân và đồng loại được xử lý và bảo quản đông lạnh. Khi kết thúc điều kiện hóa, tiến hành phá đông khối TBG và truyền cho bệnh nhân. Đồng thời làm các xét nghiệm TPTTBM, cấy máu, tỷ lệ sống chết bằng phương pháp nhuộm XanhTrypan.
- Theo dõi thời gian hồi phục bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu của các BN ghép tự thân và BN ghép đồng loại bằng xét nghiệm TPTTBM hàng ngày.
2.2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.2.1 Khối TBG thu nhận và một số yếu tố liên quan:
• Đặc điểm khối TBG thu nhận: Thể tích khối tế bào gốc, số lượng tế bào CD34+, các chỉ số huyết học khối tế bào gốc.
• Yếu tố dự đoán số lượng tế bào CD34+ thu được.
• Một số yếu tố liên quan đến kết quả thu nhận: Yếu tố người hiến/bệnh nhân, tình trạng bệnh, máy gạn, thể tích xử lý, thời gian xử lý.
2.2.2.2 Một số đặc điểm của khối TBG đông lạnh
• Khối TBG đông lạnh: Thể tích khối TBG đông lạnh, Thể tích dung dịch bảo quản, thời gian bảo quản, tỷ lệ thu hồi tế bào có nhân (TBCN),
tỷ lệ TBCN sống, mối liên quan tỷ lệ tế bào sống và một số chỉ số của đơn vị khối TBG bảo quản.
• Thời gian hồi phục bạch cầu trung tính và tiểu cầu của các BN ghép tự thân và đồng loại.
2.2.3 Vật liệu, trang thiết bị kỹ thuật và sinh phẩm
2.2.3.1 Vật liệu nghiên cứu
- 2ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA/lần làm xét nghiệm TPTTBM hàng ngày trong thời gian huy động của BN/NH, và xét nghiệm đếm tế bào CD34+ ngày thứ 4 của quá trình huy động.
- 1 ml mẫu đơn vị khối TBG thu nhận làm xét nghiệm TPTTBM, xét nghiệm đếm tế bào CD34+ .
- 1ml mẫu đơn vị khối TBG đông lạnh sau phá đông làm xét nghiệm TPTTBM, xét nghiệm xác định tỷ lệ tế bào TBCN sống bằng phương pháp nhuộm XanhTrypan.
- 2 ml mẫu đơn vị khối TBG đông lạnh sau phá đông làm xét nghiệm cấy vi khuẩn và nấm.
2.2.3.2 Trang thiết bị kỹ thuật và sinh phẩm:
Cho quá trình thu nhận TBG:
- G-CSF (Filgrastim: biệt dược là Neupogen 300µg).
- Máy gạn tách tế bào tự động: Cobe- Spectra version 7.0 của Nhật, máy Optia version 7 của Mỹ, máy COMTEC Fresinius của Đức và bộ kit tách tế bào tương ứng.
Cho quá trình giảm thể tích và bảo quản đông lạnh: - Phòng sạch.
- Bàn ép huyết tương (Terumo, Nhật Bản), kẹp túi máu. - Tủ sinh học vô trùng cấp II .
- DMSO 100% của Đức; Dextran T40 của Đức.
- Túi bảo quản chuyên dụng 50- 100ml (Gambro, Mỹ).
- Máy hạ lạnh tự động CryoMed Controlled Rate Freez của Thermoscientific của Mỹ.
- Hệ thống bình bảo quản và cấp Nito lỏng (MVE, Mỹ). - Bể ấm 37oC (Bain marie).
Để đánh giá các chỉ số nghiên cứu:
- Máy đếm tế bào tự động Beckman Coulter của Mỹ. - Kính hiển vi quang học Nikon của Nhật .
- Máy Flowcytometry FC500 của Mỹ, bộ panel kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang: CD34/CD45, 7 ADD, CD45/ Control.
- Dung dịch Xanh Trypan 0.4%.
2.2.4 Quy trình kỹ thuật áp dụng
2.2.4.1 Thăm khám lâm sàng, tra cứu hồ sơ bệnh án
Lựa chọn các bệnh nhân, người hiến theo tiêu chuẩn. Tiến hành thăm khám lâm sàng, tra cứu hồ sơ bệnh án lấy các chỉ tiêu về lâm sàng và xét nghiệm theo mẫu bệnh án nghiên cứu.
• Bệnh nhân Đa u tủy xương có chỉ định ghép tự thân tại Viện: Tuổi< 65; không mắc các bệnh tim, phổi, gan, thận mãn tính; được sự đồng ý của Hội đồng khoa học kỹ thật của Viện, gia đình BN và BN đồng ý ghép.
• Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn ở BN Đa u tủy xương là: Không còn Immunoglolin đơn dòng và âm tính tính với immunofixation. Tỷ lệ các
tế bào dòng plasma trong tủy <5%. Không còn biểu hiện khối u tương bào nếu có .
• Bệnh nhân ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại: Là những BN tuổi< 55 tuổi, bị các bệnh máu: Lơ xê mi cấp, Lơ xê mi kinh, Rối loạn sinh tủy, Suy tủy xương, Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm,… BN không mắc các bệnh tim, gan, thận, phổi mạn tính. Được sự đồng ý của hội đồng khoa học kỹ thuật của Viện, gia đình BN và BN đồng ý ghép.
• Người hiến tế bào gốc: Là các anh chị em ruột của BN có chỉ định ghép tế bào gốc đồng loại, khỏe mạnh, không mắc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu (HIV, HBV, HCV, Giang mai, sốt rét, CMV ), phù hợp HLA tối thiểu 5/6 alen của các nhóm (loci ) HLA - DR, A, B; đồng ý hiến tế bào gốc.
2.2.4.2 Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu
Máu ngoại vi của BN/NH, cũng như mẫu đơn vị khối TBG được xét nghiệm TPTTBM bằng máy đếm tế bào tự động Beckman Coulter theo quy trình tại Khoa Tế bào- Tổ chức học của Viện.
Kéo lam xác định các thành phần tế bào: Bạch cầu hạt (BC) chưa trưởng thành - là tất cả BC hạt ngoại trừ BC đoạn trung tính, BC đoạn ưa acid, BC đoạn ưa bazơ. Tế bào đơn nhân (TBĐN) gồm tế bào Mono và tế bào Lympho.
Tiêu chuẩn hồi phục bạch cầu đoạn trung tính và tiểu cầu: dựa vào xét nghiệm TPTTBM ngoại vi hàng ngày của BN được ghép tự thân và đồng loại :
- BC đoạn trung tính ≥ 0,5G/l trong 3 ngày liên tục
- TC ≥20G/l trong 3 ngày liên tiếp mà trước đó không truyền TC 3 ngày.
Máu ngoại vi của BN/NH trước gạn tách, mẫu đơn vị khối TBG thu nhận được đếm số lượng tế bào CD34+ bằng bộ panel kháng thể đơn dòng (CD34/CD45, AAD, CD34/Control ) của hãng Beckman Coulter trên máy đếm tế bào theo dòng chảy Flowcytometry FC 500 theo quy trình đếm tế bào CD34+ tại khoa Miễn dịch của Viện.
Tiêu chuẩn huy động nghèo: Theo GIBMT , số lượng TB CD34+ ngày thứ 4 của phác đồ huy động < 20 TB/µl.
2.2.4.4 Quy trình huy động tế bào gốc máu ngoại vi
Huy động tế bào gốc máu ngoại vi được thực hiện tại khoa Ghép tế bào gốc tạo máu, Viện Huyết học Truyền máu TW theo quy trình trong quyển: “ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật bệnh viện tập III”.
Toàn bộ BN/NH được huy động với G-CSF đơn thuần liều khoảng 10µg/kg cân nặng/ ngày, tiêm dưới da chia 2 lần/ ngày. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu hàng ngày và đếm số lượng TB CD34+ vào ngày thứ 4, nếu TB CD34+ >10TB/µl, tiến hành thu nhận vào ngày thứ 5.
2.2.4.5 Quy trình thu nhận khối tế bào gốc
Thu nhận tế bào gốc được thực hiện bởi 3 hệ thống máy tách tự động: Cobe-Spectra version 7.0 của Nhật, máy Optia version 7.0 của Mỹ, máy COMTEC Fresenius của Đức. Quy trình được thực hiện tại Trung tâm Tế bào gốc và khoa H7 của Viện HH- TM Trung Ương, dựa trên quy trình thu nhận tế bào đơn nhân các máy và của AABB . Bao gồm các bước cơ bản sau:
• Chuẩn bị máy, kít tách và dung dịch chống đông.
• Đặt 2 đường truyền, ưu tiên tĩnh mạch lớn đặt đường vào (inlet), tĩnh mạch còn lại đặt đường trở về.
• Nhập các thông số cần thiết: chiều cao, cân nặng, giới, hematocrit, số lượng bạch cầu.
• Chọn chương trình gạn tách tế bào đơn nhân (TBĐN), thể tích xử lý mỗi chu kỳ, tổng thể tích xử lý từng BN/NH (thông thường khoảng
2-3 lần thể tích máu của bệnh nhân và người cho), thời gian xử lý trung bình 200- 300phút.
• Dùng chống đông ACD-A với tỷ lệ: Thể tích vào (inlet volume)/ thể tích chống đông 1/10 - 1/15.
• Theo dõi các biểu hiện lâm sàng trong suốt quá trình tách.
• Xét nghiệm:TPTTBM, đếm số lượng TB CD34+ sau thu nhận.
• Ngừng thu nhận khi đạt đủ số lượng tế bào CD34+ yêu cầu.
2.2.4.5 Quy trình giảm thể tích và bảo quản khối TBG đông lạnh
- Được thực hiện tại Trung tâm Tế bào gốc, Viện Huyết học truyền máu Trung ương.
- Quy trình giảm thể tích huyết tương, dựa trên quy trình của G.S Đỗ Trung Phấn :
• Tính lượng huyết tương loại bỏ để đưa nồng độ TBCN là 500G/L.
• Ly tâm đơn thuần với lực ly tâm khoảng 1000g tương ứng 1410rpm trong 10 phút ở nhiệt độ 10oC.
• Sau ly tâm, sử dụng bàn ép tự động lấy lượng huyết tương loại bỏ ra túi chất dẻo.
Quy trình bảo quản đông lạnh :
• Dung dịch bảo quản: Gồm DMSO và DextranT40 với tỷ lệ thể tích 1:1, lượng thể tích dung dịch bảo quản = ¼ thể tích khối TBG sau giảm thể tích huyết tương= 1/5 thể tích khối TBG bảo quản (Đảm bảo nồng độ cuối cùng của DMSO là 10%, nồng độ TBCN khoảng 400G/L). Sau đó để dung dịch bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC trong 10 phút.
- Hạ lạnh theo chương trình hạ lạnh tự động dành cho tế bào gốc máu ngoại vi của máy hạ lạnh tự động CryoMed Controlled Rate Freez. Gồm các bước cơ bản sau :
• Để buồng ở 2oC đến khi mẫu đạt 4oC.
• Giảm nhiệt độ buồng 1oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt – 20.0 oC.
• Giảm 20 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt – 50 oC.
• Tăng 20 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 25 oC.
• Giảm 1 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 45 oC.
• Giảm 10 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 100 oC.
• Kết thúc quá trình hạ lạnh, chuyển sang lưu trữ trong bình Nito lỏng ở nhiệt độ -196 oC.
- Thời gian bảo quản: Phụ thuộc từng bệnh nhân. Nếu bệnh nhân có chỉ định ghép sớm thời gian bảo quản sẽ ngắn (từ vài ngày đến vài tuần).
Quy trình phá đông và truyền cho bệnh nhân
- Quy trình phá đông được thực hiện tại giường bệnh dựa trên quy trình phá đông của GS. Đỗ Trung Phấn : Đặt túi TBG trong Bain marrie ở nhiệt độ 37oC đến khi tan đông, (thông thường 5-7 phút) và không để tan đông hoàn toàn, phá đông đến khi còn một số cục nước đá.
- Truyền khối TBG cho bệnh nhân nhanh nhất có thể qua đường tĩnh mạch trung tâm hay tĩnh mạch ngoại biên nếu tình trạng ven tốt. Truyền tốt nhất không quá 30 phút.
2.2.4.7 Kiểm tra chất lượng khối tế bào gốc sau bảo quản
a. Cấy vi khuẩn
Được thực hiện tại Khoa Vi sinh của Viện HH- TM Trung ương. Cấy vi khuẩn và nấm bằng máy Batec.
b. Xác định tỷ lệ TBCN sống theo phương pháp nhuộm XanhTrypan
Được tiến hành tại Trung tâm tế bào gốc, dựa trên quy trình của AABB . Mẫu phẩm được lấy sau khi phá đông sẽ được tiến hành nhuộm với dung dịch XanhTrypan 0.4%. Xác định TBCN sống và TBCN chết dưới ính hiển vi
quang học. Tế bào sống là những tế bào sáng, hình tròn, phản quang. Các tế bào chết là những tế bào nhuộm mầu xanh, trương to, không phản quang. Tỷ lệ tế bào sống được xác định theo công thức sau:
Tổng sô tế bào sống đếm được Tổng số tế bào đếm được
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Khối TBG tươi Khối TBG đông lạnh
Thu nhận khối TBG với hệ thống máy COMTEC, Optia, Cobe Cobe
Theo dõi thời gian mọc ghép
Bệnh nhân Người hiến G-CSF Mục tiêu 1: Khảo sát kết quả thu nhận tế bào gốc Mục tiêu 2: Đặc điểm khối TBG đông lạnh
2.3 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các dữ liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê y học với phần mềm SPSS 16.0.
Mô tả kết quả:
Các biến số định lượng được trình bày theo giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ( ± SD).
Các biến số định tính được trình bày theo tỷ lệ %. Đánh giá sự khác biệt:
Đối với biến định tính: Sử dụng phép toán thống kê χ2, tỷ suất chênh OR để phân tích mối liên quan.
Đối với các biến định lượng sử dụng kiểm định Mann Whitney U. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0.05.
Mối tương quan giữa hai biến định lượng được đánh giá bằng hệ số tương quan r của Spearman giá trị r trong khoảng từ - 1 đến + 1; | r | càng gần 1 thì mối tương quan giữa hai đại lượng càng cao, r>0: tương quan đồng biến, r<0: Tương quan nghịch biến.
0,9 < | r | Tương quan rất chặt chẽ 0,7 < | r | < 0,9 Tương quan chặt chẽ 0,5 < | r | < 0,7 Tương quan khá chặt chẽ 0,3 < | r | < 0,5 Tương quan mức trung bình
2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khảo sát kết quả khối tế bào gốc thu nhận, khối tế bào gốc đông lạnh dùng trong ghép tự thân và đồng loại. Từ đó cung cấp thêm một số thông tin cho Viện, bác sỹ, bệnh nhân. Với hy vọng cung cấp khối tế bào gốc tốt nhất với giá thành rẻ nhất cho phương pháp điều trị ghép tế bào gốc tạo máu. Bệnh nhân, người hiến tự nguyện tham gia vào nghiên cứu.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN TẾ BÀO GỐC MÁU NGOẠI VI 3.1.1 Kết quả thu nhận tế bào gốc máu ngoại vi nhóm người hiến 3.1.1 Kết quả thu nhận tế bào gốc máu ngoại vi nhóm người hiến
a. Đặc điểm của người hiến trước thu nhận:
Bảng 3.1. Đặc điểm nhóm người hiến trước thu nhận
Chỉ số Nam Nữ Chung Số lượng 9(56%) 6(44%) 16 Tuổi (năm) 29 ± 10 (13 - 49) 31 ± 9 (25 - 51) 30 ± 9 (13 - 51) Cân nặng trung bình (kg) 57 ± 9 (50 - 80) 55 ± 5 (53 - 62) 56 ± 8 (50 - 80) Số lượng TC (G/L) 320 ± 39 310 ± 43 315 ± 30 Số lượng TB CD34+
máu ngoại vi(TB/µl)
80 ± 50 (28 – 162) 110 ± 45 (46 – 175) 93 ± 50 (28 – 175) Số lượng TBCN ngày thứ tư huy động 54 ± 9,9 (40 – 65) 52 ± 12 (53 – 77,7) 53 ± 12 (35,7- 77,7)
Nhận xét: Ở nhóm người hiến, số lượng người hiến nam là 9 người, người hiến nữ là 7 người. Độ tuổi trung bình của người hiến là khá trẻ, trung bình là 30 tuổi, người hiến ít tuổi nhất là 13 tuổi cao tuổi nhất là 51 tuổi. Cân nặng trung bình là 56kg, trong đó cân nặng nhẹ nhất là 50kg. Kết quả huy động phác đồ G-CSF đơn độc là: Ngày thứ tư của phác đồ, đã có lượng cao tế bào CD34+ ra máu ngoại vi, với giá trị trung bình là 93 TB/µl. Số lượng TBCN tăng khá cao, trung bình là 53G/L.
b. Đặc điểm quá trình thu nhận nhóm người hiến
Chỉ số n ± SD Khoảng giá trị
Thời gian xử lý(phút) 16 280 ± 35 250 – 320 Thể tích thu nhận(ml) 16 396 ± 86 289 – 410 Thể tích máu xử lý(lít) 16 11,8± 1,3 9 – 13 Thể tích xử lý/thể tích người hiến(Lần) 16 3,0± 0,3 2,4-3,5