2.2.4.1 Thăm khám lâm sàng, tra cứu hồ sơ bệnh án
Lựa chọn các bệnh nhân, người hiến theo tiêu chuẩn. Tiến hành thăm khám lâm sàng, tra cứu hồ sơ bệnh án lấy các chỉ tiêu về lâm sàng và xét nghiệm theo mẫu bệnh án nghiên cứu.
• Bệnh nhân Đa u tủy xương có chỉ định ghép tự thân tại Viện: Tuổi< 65; không mắc các bệnh tim, phổi, gan, thận mãn tính; được sự đồng ý của Hội đồng khoa học kỹ thật của Viện, gia đình BN và BN đồng ý ghép.
• Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn ở BN Đa u tủy xương là: Không còn Immunoglolin đơn dòng và âm tính tính với immunofixation. Tỷ lệ các
tế bào dòng plasma trong tủy <5%. Không còn biểu hiện khối u tương bào nếu có .
• Bệnh nhân ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại: Là những BN tuổi< 55 tuổi, bị các bệnh máu: Lơ xê mi cấp, Lơ xê mi kinh, Rối loạn sinh tủy, Suy tủy xương, Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm,… BN không mắc các bệnh tim, gan, thận, phổi mạn tính. Được sự đồng ý của hội đồng khoa học kỹ thuật của Viện, gia đình BN và BN đồng ý ghép.
• Người hiến tế bào gốc: Là các anh chị em ruột của BN có chỉ định ghép tế bào gốc đồng loại, khỏe mạnh, không mắc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu (HIV, HBV, HCV, Giang mai, sốt rét, CMV ), phù hợp HLA tối thiểu 5/6 alen của các nhóm (loci ) HLA - DR, A, B; đồng ý hiến tế bào gốc.
2.2.4.2 Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu
Máu ngoại vi của BN/NH, cũng như mẫu đơn vị khối TBG được xét nghiệm TPTTBM bằng máy đếm tế bào tự động Beckman Coulter theo quy trình tại Khoa Tế bào- Tổ chức học của Viện.
Kéo lam xác định các thành phần tế bào: Bạch cầu hạt (BC) chưa trưởng thành - là tất cả BC hạt ngoại trừ BC đoạn trung tính, BC đoạn ưa acid, BC đoạn ưa bazơ. Tế bào đơn nhân (TBĐN) gồm tế bào Mono và tế bào Lympho.
Tiêu chuẩn hồi phục bạch cầu đoạn trung tính và tiểu cầu: dựa vào xét nghiệm TPTTBM ngoại vi hàng ngày của BN được ghép tự thân và đồng loại :
- BC đoạn trung tính ≥ 0,5G/l trong 3 ngày liên tục
- TC ≥20G/l trong 3 ngày liên tiếp mà trước đó không truyền TC 3 ngày.
Máu ngoại vi của BN/NH trước gạn tách, mẫu đơn vị khối TBG thu nhận được đếm số lượng tế bào CD34+ bằng bộ panel kháng thể đơn dòng (CD34/CD45, AAD, CD34/Control ) của hãng Beckman Coulter trên máy đếm tế bào theo dòng chảy Flowcytometry FC 500 theo quy trình đếm tế bào CD34+ tại khoa Miễn dịch của Viện.
Tiêu chuẩn huy động nghèo: Theo GIBMT , số lượng TB CD34+ ngày thứ 4 của phác đồ huy động < 20 TB/µl.
2.2.4.4 Quy trình huy động tế bào gốc máu ngoại vi
Huy động tế bào gốc máu ngoại vi được thực hiện tại khoa Ghép tế bào gốc tạo máu, Viện Huyết học Truyền máu TW theo quy trình trong quyển: “ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật bệnh viện tập III”.
Toàn bộ BN/NH được huy động với G-CSF đơn thuần liều khoảng 10µg/kg cân nặng/ ngày, tiêm dưới da chia 2 lần/ ngày. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu hàng ngày và đếm số lượng TB CD34+ vào ngày thứ 4, nếu TB CD34+ >10TB/µl, tiến hành thu nhận vào ngày thứ 5.
2.2.4.5 Quy trình thu nhận khối tế bào gốc
Thu nhận tế bào gốc được thực hiện bởi 3 hệ thống máy tách tự động: Cobe-Spectra version 7.0 của Nhật, máy Optia version 7.0 của Mỹ, máy COMTEC Fresenius của Đức. Quy trình được thực hiện tại Trung tâm Tế bào gốc và khoa H7 của Viện HH- TM Trung Ương, dựa trên quy trình thu nhận tế bào đơn nhân các máy và của AABB . Bao gồm các bước cơ bản sau:
• Chuẩn bị máy, kít tách và dung dịch chống đông.
• Đặt 2 đường truyền, ưu tiên tĩnh mạch lớn đặt đường vào (inlet), tĩnh mạch còn lại đặt đường trở về.
• Nhập các thông số cần thiết: chiều cao, cân nặng, giới, hematocrit, số lượng bạch cầu.
• Chọn chương trình gạn tách tế bào đơn nhân (TBĐN), thể tích xử lý mỗi chu kỳ, tổng thể tích xử lý từng BN/NH (thông thường khoảng
2-3 lần thể tích máu của bệnh nhân và người cho), thời gian xử lý trung bình 200- 300phút.
• Dùng chống đông ACD-A với tỷ lệ: Thể tích vào (inlet volume)/ thể tích chống đông 1/10 - 1/15.
• Theo dõi các biểu hiện lâm sàng trong suốt quá trình tách.
• Xét nghiệm:TPTTBM, đếm số lượng TB CD34+ sau thu nhận.
• Ngừng thu nhận khi đạt đủ số lượng tế bào CD34+ yêu cầu.
2.2.4.5 Quy trình giảm thể tích và bảo quản khối TBG đông lạnh
- Được thực hiện tại Trung tâm Tế bào gốc, Viện Huyết học truyền máu Trung ương.
- Quy trình giảm thể tích huyết tương, dựa trên quy trình của G.S Đỗ Trung Phấn :
• Tính lượng huyết tương loại bỏ để đưa nồng độ TBCN là 500G/L.
• Ly tâm đơn thuần với lực ly tâm khoảng 1000g tương ứng 1410rpm trong 10 phút ở nhiệt độ 10oC.
• Sau ly tâm, sử dụng bàn ép tự động lấy lượng huyết tương loại bỏ ra túi chất dẻo.
Quy trình bảo quản đông lạnh :
• Dung dịch bảo quản: Gồm DMSO và DextranT40 với tỷ lệ thể tích 1:1, lượng thể tích dung dịch bảo quản = ¼ thể tích khối TBG sau giảm thể tích huyết tương= 1/5 thể tích khối TBG bảo quản (Đảm bảo nồng độ cuối cùng của DMSO là 10%, nồng độ TBCN khoảng 400G/L). Sau đó để dung dịch bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC trong 10 phút.
- Hạ lạnh theo chương trình hạ lạnh tự động dành cho tế bào gốc máu ngoại vi của máy hạ lạnh tự động CryoMed Controlled Rate Freez. Gồm các bước cơ bản sau :
• Để buồng ở 2oC đến khi mẫu đạt 4oC.
• Giảm nhiệt độ buồng 1oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt – 20.0 oC.
• Giảm 20 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt – 50 oC.
• Tăng 20 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 25 oC.
• Giảm 1 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 45 oC.
• Giảm 10 oC/ phút đến khi nhiệt độ buồng đạt - 100 oC.
• Kết thúc quá trình hạ lạnh, chuyển sang lưu trữ trong bình Nito lỏng ở nhiệt độ -196 oC.
- Thời gian bảo quản: Phụ thuộc từng bệnh nhân. Nếu bệnh nhân có chỉ định ghép sớm thời gian bảo quản sẽ ngắn (từ vài ngày đến vài tuần).
Quy trình phá đông và truyền cho bệnh nhân
- Quy trình phá đông được thực hiện tại giường bệnh dựa trên quy trình phá đông của GS. Đỗ Trung Phấn : Đặt túi TBG trong Bain marrie ở nhiệt độ 37oC đến khi tan đông, (thông thường 5-7 phút) và không để tan đông hoàn toàn, phá đông đến khi còn một số cục nước đá.
- Truyền khối TBG cho bệnh nhân nhanh nhất có thể qua đường tĩnh mạch trung tâm hay tĩnh mạch ngoại biên nếu tình trạng ven tốt. Truyền tốt nhất không quá 30 phút.
2.2.4.7 Kiểm tra chất lượng khối tế bào gốc sau bảo quản
a. Cấy vi khuẩn
Được thực hiện tại Khoa Vi sinh của Viện HH- TM Trung ương. Cấy vi khuẩn và nấm bằng máy Batec.
b. Xác định tỷ lệ TBCN sống theo phương pháp nhuộm XanhTrypan
Được tiến hành tại Trung tâm tế bào gốc, dựa trên quy trình của AABB . Mẫu phẩm được lấy sau khi phá đông sẽ được tiến hành nhuộm với dung dịch XanhTrypan 0.4%. Xác định TBCN sống và TBCN chết dưới ính hiển vi
quang học. Tế bào sống là những tế bào sáng, hình tròn, phản quang. Các tế bào chết là những tế bào nhuộm mầu xanh, trương to, không phản quang. Tỷ lệ tế bào sống được xác định theo công thức sau:
Tổng sô tế bào sống đếm được Tổng số tế bào đếm được
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Khối TBG tươi Khối TBG đông lạnh
Thu nhận khối TBG với hệ thống máy COMTEC, Optia, Cobe Cobe
Theo dõi thời gian mọc ghép
Bệnh nhân Người hiến G-CSF Mục tiêu 1: Khảo sát kết quả thu nhận tế bào gốc Mục tiêu 2: Đặc điểm khối TBG đông lạnh