2.5.1. Phương pháp xác định nguyên nhân gây bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Đối với rễ bị bệnh: Chụp ảnh và quan sát bằng mắt thƣờng mô tả các biểu hiện bên ngoài nhƣ: màu sắc lá, tình trạng thân, rễ. Lấy mẫu rễ quan sát trên kính soi nổi, mô tả các triệu chứng nhƣ: thối, loét… Chọn những rễ con có cả phần khỏe và phần bị bệnh, rửa bằng nƣớc cất vô trùng nhiều lần, nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh và hơ khô trên đèn cồn. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1 - 2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trƣờng CMA (Corn Meal Agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml; Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol 0.05g))/lít).
- Đối với đất bị nhiễm bệnh: Dùng phƣơng pháp bẫy đất vì nó thích hợp cho việc phân lập các loài sản sinh ra du động bào tử.
+ Cho khoảng 200g đất vào một hộp nhựa
+ Đổ nƣớc vô trùng hoặc nƣớc cất vào hộp đựng sao cho ngập đất khoảng 5 - 10cm.
+ Để lắng và vớt sạch rác nổi trên bề mặt nƣớc
+ Thả vào hộp nhựa những lá non, tƣơi của cây trồng mẫn cảm với các bệnh nhƣ lá Keo tai tƣợng, lá các cây thuộc họ dẻ, lá cây đỗ quyên,... Các lá này sẽ để nổi trên mặt nƣớc (Hình 01).
+ Đặt các hộp nhựa vào 1 nơi để nguyên vị trí trong vòng 2 - 4 ngày. + Sau 1- 3 ngày phân lập nấm từ mép vết bệnh đã phát triển trên các lá bẫy sau khi rửa trong nƣớc vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trƣờng NARPH để phân lập.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1. Bẫy đất
- Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 250C cấy truyền từng tản nấm lên môi trƣờng PDA hoặc môi trƣờng CMA và quan sát hàng ngày dƣới kính lúp soi nổi để kiểm tra nấm mọc từ các miếng rễ cây hoặc các mảnh vật liệu bẫy bị nhiễm bệnh. Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trƣởng của sợi nấm trên môi trƣờng CMA.
- Phân lập nấm gây bệnh.
- Sau khi nấm gây bệnh đƣợc phân lập và mọc kín đĩa Petri, cắt thành các miếng nhỏ có diện tích 0,5 x 0,5 cm cho vào nƣớc chiết đất đã đƣợc lọc kỹ để trong đĩa Petri sạch. Sau 24 giờ kiểm tra sự xuất hiện của các dạng bào tử: bào tử noãn (Oogonia), bào tử áo (Chlamydospore) và túi động bào tử (Sporangia) dƣới kính hiển vi. Tiến hành đo kích thƣớc của các loại bào tử.
- Phương pháp thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo là phƣơng pháp kiểm tra và khẳng định đƣợc loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên rễ có chính xác hay không.
Phƣơng pháp thí nghiệm: Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm bằng que cấy inox đƣợc khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nƣớc vô trùng tới khi mật độ đạt khoảng 1 x 106 tế bào/ml. Tƣới dung dịch bào tử vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các cây con trồng thí nghiệm. Cây đối chứng tƣới nƣớc. Quan sát thí nghiệm, ghi chéo triệu chứng xảy ra đối với cây con thí nghiệm và cây đối chứng.
- Giám định loài nấm gây bệnh
Định loài nấm gây bệnh dựa theo tài liệu chuyên khảo về nấm, đặc biệt các chuyên khảo về Phytopthora của Waterhouse & Waterston (1966) [59].
2.5.2. Phương pháp điều tra đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái đến tỷ lệ và mức độ bị bệnh
2.5.2.1. Điều tra sơ bộ
Phƣơng pháp điều tra sơ bộ: Lập các tuyến điều tra đại diện cho các dạng địa hình, loài cây, đất đai, thực bì. Tuyến điều tra đi theo đƣờng đồng mức, đƣờng mòn. Trên tuyến, cứ cách 100 m lại xác định một điểm điều tra vuông góc với tuyến và cách tuyến điều tra 20 m. Căn cứ vào kết quả điều tra để xác định điểm bị bệnh hại rễ Keo, khoanh trên bản đồ địa hình hoặc bản đồ hiện trạng sử dụng đất những diện tích bị bệnh hại làm cơ sở cho điều tra tỷ mỉ.
2.5.2.2. Điều tra tỷ mỉ
Mục đích là để nắm vững tình hình phân bố, mức độ bị hại đồng thời nghiên cứu mối quan hệ giữa vật gây bệnh và các nhân tố sinh thái xung quanh ảnh hƣởng tới sự phát sinh, sinh trƣởng và phát triển của bệnh.
Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình nhƣ chân, sƣờn, đỉnh; hƣớng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 200 m2 (10 m x 20 m), dung lƣợng mẫu điều tra đủ lớn n 30). Sau khi điều tra trên ô tiêu chuẩn tỷ lệ và mức độ bị bệnh đƣợc tính toán nhƣ sau :
* Điều tra tỷ lệ bị bệnh (P%).
Trong mỗi ô tiêu chuẩn, đếm tổng số cây điều tra và số cây bị bệnh hại rễ trong ô. Tỷ lệ bị bệnh trong ô tiêu chuẩn đƣợc tính theo công thức của James năm 1974 nhƣ sau qua (CT 2 - 1):
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn P = *100 N n (CT 2 - 1) Trong đó: P là tỷ lệ bị bệnh (%). n là số cây bị bệnh.
N là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn.
* Mức độ bị bệnh (R%).
Điều tra toàn bộ số cây trong ô tiêu chuẩn (sao cho dung lƣợng mẫu đủ lớn n 30). Bệnh hại rễ thƣờng làm cho các rễ con bị thối, không có khả năng hút nƣớc và dinh dƣỡng cung cấp cho cây dẫn đến lá cây ở ngọn bị héo và khô cành ngọn. Phân cấp bệnh dựa trên tình trạng thân, cành ngọn bị khô, héo, theo Kenneth Old và cộng sự năm 2000 có 5 cấp nhƣ sau :
Cấp 0 : Cây khỏe, không bị bệnh.
Cấp I : < 10 % diện tích thân, cành ngọn bị bệnh. Cấp II : 10 25 % diện tích thân, cành ngọn bị bệnh. Cấp III : 26 50 % diện tích thân, cành ngọn bị bệnh.
Cấp IV : > 50 % diện tích thân, cành ngọn bị bệnh, cây bị khô ngọn. Mức độ bị bệnh đƣợc tính theo công thức:
Ri =
∑Ri*vi N*V Với: Ri: Mức độ bị bệnh OTC i
vi tƣơng ứng với các cấp bệnh từ 0 – 4 N: Tổng số cây OTC
V: Cấp bị bệnh lớn nhất (V = 4)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Rtb = Ri
n
(CT 2 - 2)
Trong đó: Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra. Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn. n là tổng số ô tiêu chuẩn.
Sau khi tính toán mức độ bị hại, căn cứ vào các chỉ tiêu sau để đánh giá: R ≤ 10 % : Cây khoẻ
10 % < R ≤ 15 % : Cây bị bệnh nhẹ.
15 % < R ≤ 25 % : Cây bị bệnh trung bình. 25 % < R ≤ 50 % : Cây bị bệnh nặng. R > 50 % : Cây bị bệnh rất nặng.
2.5.3. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vật gây bệnh
2.5.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm nẩy mầm của bào tử nấm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA, đặt trong tủ định ôn có các mức nhiệt độ không khí khác nhau. Phƣơng pháp thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Đổ môi trƣờng dinh dƣỡng PDA đã nấu vào đĩa petri đƣợc khử trùng dầy 2 - 3 mm, để nguội cho môi trƣờng đông cứng lại, cấy giống nấm đã đƣợc phân lập từ 10 - 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng rồi băng lại cho kín. Xếp các hộp lồng vào tủ định ôn có nhiệt độ: 200C ± 1; 250C ± 1; 300C ± 1; 350C ± 1, mỗi tủ đặt 2 hộp lồng. Đo đƣờng kính của khuẩn lạc theo hai chiều vuông góc, lấy trị số trung bình và đo ở ngày thứ 3 - 6. Thí nghiệm đƣợc lập lại 2 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
T =
t
1
xL (CT 2 - 3)
Trong đó : T là tốc độ nảy mầm của bào tử nấm t là thời gian.
L là chiều dài trung bình của sợi nấm sau thời gian t giờ 2.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của khuẩn lạc
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Both.C. Dung dịch NaCL đƣợc pha với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm tạo cho chúng ta có đƣợc các độ ẩm nhƣ sau:
NaCl (g/lít) 0 16 32 48 64
RH% 100 90 80 70 60
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở phòng thí nghiệm, trong tối có nhiệt độ không khí khoảng 23 - 270C. Sau 3 ngày trong các bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm không khí khác nhau, phụ thuộc vào nồng độ của NaCl, khi nồng độ của NaCl càng lớn thì độ ẩm của môi trƣờng càng nhỏ và ngƣợc lại nồng độ của NaCl càng nhỏ thì độ ẩm của môi trƣờng càng lớn. Môi trƣờng PDA sau khi hấp khử trùng đƣợc đổ vào hộp lồng đã đƣợc khử trùng một lớp dày 2 - 3 mm. Cấy giống nấm đã đƣợc phân lập từ 10 - 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng bằng que cấy. Đặt hộp lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm không khí khác nhau, mỗi bình ta đặt 2 hộp. Sau 3 ngày lấy hộp lồng đo đƣờng kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông góc, lấy trị số bình quân của các hộp lồng đặt trong mỗi bình hút ẩm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần.
2.5.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ sinh trưởng phát triển của khuẩn lạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA có độ pH khác nhau. Môi trƣờng lỏng nƣớc khoai tây, đã đun sôi và lọc, cho vào 20g thạch và 4g đƣờng D - glucoza, một lít môi trƣờng cho đều vào 5 bình tam giác có dung tích 250 ml. Dùng máy đo pH để xác định trị số pH của môi trƣờng. Dung dịch gốc có pH = 6,0; dùng HCL 10% để điều chỉnh các mức pH của môi trƣờng là: 4,0; 5,0 và NaOH để điều chỉnh pH môi trƣờng theo các mức: 7,0; 8,0. Sau đó nút miệng bình tam giác bằng bông sạch và quấn giấy báo phía trên, môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 atm trong 30 phút. Đổ mỗi môi trƣờng có các mức pH khác nhau vào 3 hộp lồng đã đƣợc khử trùng dày 2 - 3 mm. Sau khi mặt thạch khô, đông cứng lại rồi tiến hành cấy vào chính giữa hộp lồng 1 điểm giống nhau đúng bằng que cấy. Băng kín hộp lồng lại và để trong tủ định ôn có nhiệt độ 250C ± 1. Đo đƣờng kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình, đo ở ngày thứ 3 - 7. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần và lấy trị số đƣờng kính khuẩn lạc bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phần mềm Exel và phần mềm SPSS 13.0.
2.5.5. Đề xuất biện pháp phòng trừ
Hiện nay biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất là biện pháp phòng trừ tổng hợp gồm các biện pháp kỹ thuật lâm sinh, biện pháp sinh học, biện pháp hóa học,...
Biện pháp kỹ thuật lâm sinh, biện pháp sinh học đƣợc đề xuất dựa trên các tài liệu tham khảo Schmitthenner, A.F. and R.G. Bhat. 1994; Phytophthora Technical Group, 2006 [58], [52] và những kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái của vật gây bệnh.
Biện pháp hóa học đƣợc đề xuất dựa trên thí nghiệm xác định loại thuốc đặc hiệu đƣợc tiến hành trong phòng thí nghiệm. Dựa theo một số tài liệu nghiên cứu về kiểm soát nấm Pythium bằng thuốc hóa học theo JJ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bezuidenhout, JM Darvas &JC Toerien,1987 [47] và Coffey, M D & Joseph, M C 1985 [42]. Thử nghiệm trên 3 loại thuốc là: Agri-Fos 400; Phos-inject 200; Ridomil. Nồng độ pha lần lƣợt nhƣ sau Agri-Fos 400 pha 2,5- 5ml/l; Phos-inject 200 pha 5-10ml/l; Ridomil pha 5g/l.
Mỗi loại cấy trên 3 đĩa petri và có đĩa petri đối chứng. Trƣớc tiên đục một lỗ thạch có đƣờng kính 1cm ở giữa hộp lồng, cấy nấm ở ba điểm góc hộp lồng tạo thành một tam giác. Dùng pipét hút dịch thuốc đã pha theo đúng nồng độ cho vào lỗ đục, băng kín và để ở tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC. Sau 24 giờ; 48 giờ và 60 giờ kiểm tra và đo vòng kháng nấm của thuốc so với đối chứng.
Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng nấm bằng cách đo khoảng cách từ tâm đĩa petri cho đến đỉnh sinh trƣởng của sợi nấm. Khoảng cách càng lớn thì khả năng kháng nấm càng cao. Làm cơ sở cho việc lựa chọn và sử dụng thuốc phòng trừ.
CHƢƠNG III
KHÁI QUÁT VỀ ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN, KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU 3.1. Điều kiện tự nhiên
3.1.1. Vị trí địa lý
Tuyên Quang là tỉnh miền núi phía Bắc có tọa độ địa lý từ 21o29’ ÷ 22o42’ vĩ độ Bắc và 104o50’ ÷ 105o36’ kinh độ Đông.
- Phía Bắc và Tây Bắc giáp tỉnh Hà Giang. - Phía Đông giáp tỉnh Bắc Kạn, Thái Nguyên. - Phía Nam giáp tỉnh Phú Thọ.
- Phía Đông Nam giáp tỉnh Vĩnh Phúc. - Phía Tây giáp tỉnh Yên Bái.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Về đơn vị hành chính: tỉnh có 06 huyện và 01 thành phố với 129 xã, 07 phƣờng và 05 thị trấn
3.1.2. Địa hình, địa thế
Địa hình của Tuyên Quang khá phức tạp, bị chia cắt bởi nhiều dãy núi cao và sông suối, đặc biệt ở phía Bắc tỉnh. Phía Nam tỉnh có địa hình thấp dần, ít bị chia cắt hơn, có nhiều đồi núi thấp và thung lũng chạy dọc theo các con sông. So với các tỉnh vùng núi phía Bắc thì Tuyên Quang có độ cao trung bình không lớn, đỉnh cao nhất tỉnh là đỉnh Chạm Chu với độ cao là 1.587 m, nơi thấp nhất là ở phía Nam huyện Sơn Dƣơng độ cao 23 - 24 m so với mực nƣớc biển.
Địa hình thấp dần từ Bắc xuống Nam và chia thành 3 vùng chính sau:
* Địa hình núi cao: Là vùng núi cao nằm ở phía Bắc tỉnh bao gồm toàn bộ huyện Nà Hang, 11 xã vùng cao của huyện Chiêm Hoá, 2 xã vùng cao của huyện Hàm Yên và một phần phía Bắc của huyện Yên Sơn; Chiếm trên 50 % diện tích toàn tỉnh, độ dốc trung bình từ 20o 25o. Độ cao trung bình khoảng 660 m, địa hình giảm dần từ Bắc xuống Nam. Có một số ngọn núi cao trên 1.000m nhƣ: Cuối Toong cao 1.112m, Ta Pao cao 1.388 m, Chạm Chu cao 1.587 m. Địa hình vùng núi cao, dốc không có khả năng trữ nƣớc, thuận lợi cho việc phát triển lâm nghiệp. Ở một số nơi vùng núi đá vôi nhƣ: Na Hang, Bắc Chiêm Hoá, Sơn Dƣơng có hiện tƣợng karst, cần thận trọng khi xây dựng các công trình cấp nƣớc tránh hiện tƣợng thấm mất nƣớc.
* Địa hình vùng núi thấp: Gồm các xã của huyện Chiêm Hoá (trừ 11 xã vùng cao), huyện Hàm Yên (trừ 2 xã vùng cao), một phần phía Nam huyện Yên Sơn và huyện Sơn Dƣơng, chiếm khoảng 40% diện tích toàn tỉnh. Địa hình phức tạp, có nhiều sông suối, giao thông đi lại gặp nhiều khó khăn. Độ cao trung bình dƣới 500 m, thấp dần từ Bắc xuống Nam, độ dốc thƣờng từ 15o- 20o. Địa hình đồi núi thấp có nhiều loại hình thuỷ tự nhiên có thể đắp