3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.6.Xác định khả năng gây dung huyết của chủng vi khuẩn E coli phân lập được
lập đƣợc
Các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu của
03 huyện Hưng Hà, Kiến Xương và Thái Thụy được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết theo α, β, γ. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Huyện lượng Số chủng
Kết quả xác định khả năng gây dung huyết
α β γ (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 Hưng Hà 6 4 66.67 2 33.33 0 0 2 Kiến Xương 7 5 71.43 1 14.29 1 14.29 3 Thái Thụy 6 3 50.00 1 16.67 2 33.33 Tính chung 19 12 63.16 5 21.05 3 15.79
Từ bảng 3.12, kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng
E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu ở 03 huyện cho thấy:
- Huyện Hưng Hà: có 4/6 chủng vi khuẩn E. coli gây dung huyết trên
55
- Huyện Kiến Xương: có 5/7 chủng vi khuẩn gây dung huyết theo kiểu α chiếm tỷ lệ 71,43%, dung huyết theo kiểu β (14,29%); có14,29% chủng không gây dung huyết.
- Huyện Thái Thụy: có 3/6 chủng vi khuẩn gây dung huyết theo kiểu α chiếm tỷ lệ 50%, 1/6 chủng (16,67%) gây dung huyết theo kiểu β; 2/6 chủng (33,33%) không gây dung huyết.
Trong tổng số 19 chủng được xác định khả năng gây dung huyết có 63,16% số chủng E. coli gây dung huyết kiểu α; dung huyết kiểu β chiếm 21,05% và 15,79% chủng không gây dung huyết.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lan (2003) [12] khi xác định khả năng gây dung huyết của
các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu lợn ở Thái Nguyên và Bắc Giang.
Trong đó có 67,31% số chủng E. coli ở Thái Nguyên và 77,78% số chủng E.
coli ở Bắc Giang gây dung huyết kiểu α là 28,85% và 22,22% gây dung huyết
kiểu β.
Khi nghiên cứu vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu sau cai sữa, nhiều tác giả thường xem khả năng gây dung huyết là một chỉ tiêu để xác định vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu. Tuy nhiên, theo Bùi Lưu Ly và cs (2007)
[16] khi nghiên cứu vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu và lợn
con bị tiêu chảy đều có khả năng gây dung huyết. Trong đó có 3/24 mẫu vi
khuẩn E. coli phân lập được chiếm 12,5% không mang gen VT2e và F18
nhưng cho kết quả dung huyết dương tính. Như vậy, rõ ràng khả năng gây dung huyết không phải là đặc tính sinh học đặc trưng và không thể sử dụng
tính chất này làm yếu tố tham khảo trong chẩn đoán vi khuẩn E. coli gây bệnh
phù đầu ở lợn con sau cai sữa.
3.7. Xác định khả năng sản sinh độc tố đƣờng ruột của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
56
Các loại độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt đóng vai trò quan trọng
trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn E. coli gây bệnh. Chúng tôi đã tiến hành
xác định độc tố đường ruột (ST, LT) bằng phương pháp khuếch tán trên da thỏ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.13. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Huyện Số lượng (n) Khả năng sản sinh độc tố ST LT ST + LT + % + % + % 1 Hưng Hà 6 3 50 2 33.33 1 16.67 2 Kiến Xương 7 4 57.14 3 42.86 0 0 3 Thái Thụy 6 3 50 2 33.33 1 16.67 Tính chung 19 10 52.63 7 36.84 2 10.53
Kết quả bảng 3.13 cho thấy: có 10/19 chủng sản sinh độc tố đường ruột chịu nhiệt ST (52,63%), 7/19 chủng sản sinh độc tố đường ruột không chịu nhiệt LT (36,84%), tỷ lệ các chủng E. coli mang cả 2 độc tố ST + LT là 10,53% với 2/19 chủng. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt
và không chịu nhiệt một lần nữa khẳng định độc tố của vi khuẩn E. coli phân
lập được từ lợn mắc bệnh.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khác so với kết quả xác định độc tố
đường ruột của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu
tại Nam Định, Hưng Yên, Hà Nội có 6/10 chiếm tỷ lệ 60% chủng kiểm tra sản sinh cả 2 loại độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt, 4/10 chủng (40%) còn lại không sản sinh độc tố đường ruột (theo Lê Văn Lãnh và cs, 2008) [15].
Theo Trịnh Quang Tuyên (2006) [35], các chủng E. coli gây bệnh phù đầu ở lợn 22 - 60 ngày tuổi sản sinh ST (57,6%), LT (43,4%), và ST + LT (44,6%). Tuy nhiên, theo Nguyễn Xuân Hòa và cs (2009) [9] xác định các gen
57
tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen LT cao nhất (25/61) chiếm 40,98%, kế tiếp là
vi khuẩn E. coli mang gen STb (17/61) chiếm 27,87% và vi khuẩn E. coli
mang gen STa (9/61) chiếm 14,75%, sau cùng là vi khuẩn E. coli mang gen
sản sinh độc tố dung huyết E. coli 6/61 chiếm 19,84%. Như vậy, các chủng vi
khuẩn E. coli gây phù đầu và tiêu chảy ở lợn sản sinh độc tố đường ruột chịu
nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT) có tỷ lệ khác nhau. Vi khuẩn E. coli gây
bệnh phù đầu có thể tiết nội độc tố và độc tố verotoxin. Nội độc tố và độc tố verotoxin cùng xâm nhập vào trong máu gây nên các triệu chứng sốc nặng trên lợn thí nghiệm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) [7].
Theo Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) [34] kết quả phân tích sự có mặt của các gen quy định độc lực cũng như tổ hợp của các gen khác nhau trên cùng 1 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy tại tỉnh Phú Thọ bằng phản ứng multilex PCR cho thấy có tới 39/74 chủng (chiếm 56,5%) mang cả 2 loại độc tố enterotoxin và verotoxin.
Điều này giải thích nguyên nhân lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa có biểu hiện triệu chứng tiêu chảy
3.8. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập
Đã tiến hành thử độc lực của 19 chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc
bệnh phù đầu của các huyện Hưng Hà, Kiến Xương, Thái Thụy tỉnh Thái
Bình. Bằng cách tiêm canh khuẩn đã được bồi dưỡng 24h/370C cho mỗi
chủng cần nghiên cứu 02 chuột thí nghiệm với liều tiêm xoang bụng là 0,2ml/chuột thí nghiệm. Theo dõi số lượng chuột chết tại các thời điểm sau 8h, 24h, 32h, 48h và sau 6 ngày.
Kết quả được quả trình bày ở bảng 3.14 cho thấy:
Bảng 3.14. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập
STT Huyện Số
lượng chuột Số Liều tiêm
Thời gian theo dõi và số chuột chết (con)
Tỷ lệ chết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
58 chủng thử (con) xoang bụng (ml) Sau 8h Sau 24h Sau 32h Sau 48h Sau 6 ngày (%) 1 Hưng Hà 6 12 0.2 0 6 4 0 0 83.33 2 Kiến Xương 7 14 0.2 2 6 4 2 0 100 3 Thái Thụy 6 12 0.2 0 4 2 2 0 66.67 Cộng 19 38 0.2 2 16 10 4 0 84.21
Kết quả bảng 3.14 cho thấy: có 2/38 chuột chết chiếm 5,26% sau khi tiêm trong vòng 8h; sau khi tiêm 24h có 16/38 chuột chết (42,11%) sau khi tiêm 24h; có 10/38 chuột (26,32%) chết sau khi tiêm 32h; có 4/38 chuột (10,53%) chết sau khi tiêm 48h. Không có con chuột nào chết sau 6 ngày tiêm.
Như vậy, 19 chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Thái
Bình được thử độc lực trên 38 chuột thí nghiệm đã gây chết 32/38 chuột chiếm tỷ lệ 84,2% chuột thí nghiệm trong vòng 48h sau khi công cường độc. Kết quả
này phù hợp với kết quả thử độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn
mắc bệnh phù đầu của Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo và cs (1994) [21]; Lê Văn
Lãnh và cs (2008) [15] khi kiểm tra độc lực của 10 chủng vi khuẩn E. coli phân
lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Nam Định, Hà Nội, Hưng Yên trên chuột thí nghiệm có 9/10 chủng (90%) gây chết chuột thí nghiệm.
Các chuột chết đều được mổ khám để kiểm tra triệu chứng, bệnh tích và đều quan sát thấy các bệnh tích điển hình như: bụng chướng to, chướng hơi đường tiêu hóa, phổi viêm sưng, xuất huyết, gan tụ huyết, ruột xuất huyết. Lấy máu tim, ria cấy trên đĩa thạch máu, thạch MacConkey đều phân lập lại được vi khuẩn thuần khiết từ máu tim. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập được đều có độc lực cao và là nguyên nhân quan trọng gây bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa.
3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dƣợc của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
Để điều trị bệnh phù đầu có hiệu quả cao hơn, chúng tôi đã tiến hành thử khả năng mẫn cảm của 19 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được với 10 loại
59
kháng sinh khác nhau bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dƣợc của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Tên kháng sinh & hóa dược
Số chủng thử Đánh giá độ mẫn cảm Rất mẫn cảm Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc + % + % + % 1 Ceftazidime (Ce) 6 5 83.33 1 16.67 0 0 2 Colistin (Co) 6 3 50 2 33.33 1 16.67 3 Gentamicin (Ge) 6 3 50 1 16.67 2 33.33 4 Amoxicillin (Ac) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 5 Neomycin (N50) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 6 Norfloxacin (No) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 7 Spectinomycin (Se) 6 3 50 1 16.67 2 33.33 8 Sulfamethoxazole (S3) 6 2 33.33 3 50 1 16.67 9 Tetracyclin (Te) 6 1 16.67 2 33.33 3 50 10 Kanamycin (Kn) 6 3 50 2 33.33 1 16.67 Tính chung 60 32 53.33 15 25 13 21.67
Từ bảng 3.15, các kết quả thu được cho thấy:
- Các chủng E. coli phân lập được mẫn cảm mạnh với kháng sinh
Ceftazidime đạt tỷ lệ 83,33%; mẫn cảm bởi Amoxicillin, Norfloxacin và Neomycin chiếm 66,67%.
- Một số loại kháng sinh như Colistin, Gentamicin, Spectinomycin và Kanamycin có tỷ lệ mẫn cảm đạt 50%.
60
các chủng vi khuẩn E. coli kháng với Colistin, Amoxicilin, Norfloxacin,
Sulfamethoxazole và Kanamycin.
Một số kết quả nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của các chủng E.
coli gây bệnh phù đầu như sau:
Bùi Xuân Đồng (2002) [5] tiến hành thử kháng sinh đồ với các chủng
vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Hải Phòng mẫn cảm với
Chloramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin.
Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [14] thử kháng sinh đồ với các loại kháng sinh Cefuroxime, Akamicin, Doxycycline, Ampicilin với các chủng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu ở Thái Nguyên và Bắc Giang cho thấy: vi khuẩn E. coli rất mẫn cảm với kháng sinh Akamicin, yếu hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime.
Tính kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng có
xu hướng tăng theo thời gian sử dụng, nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc là do sử dụng kháng sinh không đúng kỹ thuật của con người, gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong Plasmid R (Resitance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp.
Vì vậy, một số loại kháng sinh có tác dụng mạnh như Ceftazidime là những kháng sinh mới nên vẫn mẫn cảm cao với các chủng vi khuẩn được thử. Còn một số loại kháng sinh khác hiện đang được sử dụng trong phòng và trị bệnh cho lợn thì có tính mẫn cảm trung bình hoặc thấp hoặc kháng theo từng địa phương khác nhau. Vì vậy, cần phải có một chiến lược sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và thú y hợp lý để hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn E. coli.
61
Hình 3.6. Biểu đồ về tỷ lệ đề kháng của E. coli với từng loại kháng sinh. 3.10. Chế tạo và kiểm nghiệm auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
3.10.1. Bồi dưỡng kháng nguyên phục vụ chế auto - vaccine
Đã tiến hành ổn định các kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F107 của các chủng E. coli phân lập được bằng cách nuôi cấy lần lượt trên các môi trường: thạch máu cừu 5%, thạch Minca, thạch Bromthymol blue, thạch Iso- sensitest + Alizaringell + Eosin. Sau đó tiến hành bồi dưỡng độc tố bằng cách nuôi cấy trong môi trường BHI. Kết quả được trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Kết quả bồi dƣỡng kháng nguyên E. coli chế tạo auto - vaccine tại Thái Bình
Chủng E. coli Yếu tố bám dính Serotype O Môi trường ổn định yếu tố bám dính
Môi trường bồi dưỡng độc tố
E/TB6 F4 O8 Thạch máu cừu 5% Bain Heart
Infusion Broth
E/TB3 F5 O139 Thạch Minca Bain Heart
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ce Co Ge Ac N50 No Se S3 Te Kn Kháng sinh Tỷ lệ %)
62
E/TB12 F107 O149 Thạch Isosensites +
Alizaringell + Eosin
Bain Heart Infusion Broth
E/TB8 F6 O141 Thạch Bromthymol
Blue
Bain Heart Infusion Broth Từ bảng trên cho thấy:
E. coli được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để bồi dưỡng sản sinh yếu tố bám dính: môi trường thạch máu cừu 5% cho yếu tố F4, thạch Minca cho F5; môi trường thạch Bromthymol Blue cho F6 và môi trường thạch Isosensites + Alizaringell + Eosin bồi dưỡng yếu tố bám dính F107.
Sau đó, chủng E. coli tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường Bain Heart Infusion Broth (BHI) để bồi dưỡng sản sinh độc tố gây bệnh. Canh khuẩn BHI được phối hợp lại theo tỷ lệ 1:1:1:1 để chế tạo auto - vaccine.
3.10.2. Kiểm tra đánh giá chất lượng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm
Lô canh khuẩn sau khi xử lý vô hoạt bằng 0,3% formalin thực hiện bồi
dưỡng canh khuẩn trong tủ ấm 370C/7 ngày liên tục.
Chúng tôi đã tiến hành xác định các chỉ tiêu chất lượng auto – vaccine trên 03 lô auto – vaccine bao gồm: xác định đậm độ canh khuẩn, kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, thuần khiết, dung huyết, nấm lần lượt trên môi trường thạch thường, thạch MacConkey, thạch máu, thạch nấm; xác định vi khuẩn yếm khí bằng cách cấy canh khuẩn trên môi trường yếm khí nước gan; kiểm tra an toàn và hiệu lực trên động vật thí nghiệm.
Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.17.
Bảng 3.17. Kết quả kiểm nghiệm chất lƣợng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
63
1 5.1 Đạt Đạt Đạt Đạt
2 5 Đạt Đạt Đạt Đạt
3 5.2 Đạt Đạt Đạt Đạt
Tính chung 5.1 Đạt Đạt Đạt Đạt
Từ bảng 3.17 kết quả cho thấy:
Đậm độ canh khuẩn xác định được trung bình là 5,1 x 109
CFU/ml bảo đảm tính kháng nguyên của auto – vaccine. Các chỉ tiêu kỹ thuật đều đạt yêu cầu bảo đảm vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực trên động vật thí nghiệm theo tiêu chuẩn của ngành.
3.11. Thử nghiệm an toàn auto - vaccine trên lợn thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm thử an toàn auto - vaccine trên lợn, lô thí nghiệm (n= 8) và đối chứng (n = 6) ở 02 giai đoạn lợn 14 ngày tuổi và 21 ngày tuổi tại một số trại chăn nuôi lợn của các địa phương nghiên cứu. Tiến hành tiêm dưới da auto – vaccine lần thứ nhất cho lợn thí nghiệm lần thứ nhất lúc 14 ngày tuổi, liều tiêm dưới da 4ml/con (gấp 2 lần liều phòng bệnh), thử an toàn lần 2 lúc lợn 21 ngày tuổi. Sau đó theo dõi phản ứng sau khi tiêm auto – vaccine của lợn thí nghiệm.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả thử an toàn auto - vaccine ở lợn thí nghiệm
Lô auto - vaccine
Lô thí nghiệm 14 ngày tuổi Lô thí nghiệm 21 ngày tuổi
Số lợn trong lô Liều tiêm dưới da (ml/con) Phản ứng cục bộ, toàn thân Số lợn trong lô Liều tiêm dưới da (ml/con) Phản ứng cục bộ, toàn thân
64
1 8 6 4 0 0 0 8 6 4 0 0 0
2 8 6 4 0 0 0 8 6 4 0 0 0
3 8 6 4 0 0 0 8 6 4 0 0 0
Ghi chú: TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng
Từ bảng 3.18 kết quả thu được cho thấy: lợn thí nghiệm ở 14 và 21 ngày tuổi đều biểu hiện bình thường như đối chứng. Qua thí nghiệm đã khẳng định