3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.4.4.Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E.
E. coli phân lập được
2.4.4.1. Xác định khả năng gây dung huyết
Vi khuẩn E. coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu
cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết:
+ Dung huyết kiểu β: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng. + Dung huyết kiểu α: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết mờ, sau đó tiếp tục để ở nhiệt độ 370
C trong 18 giờ, thấy có vòng dung huyết sáng sạch.
+ Dung huyết kiểu γ: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết hay vi khuẩn không có khả năng gây dung huyết.
2.4.4.2. Xác định yếu tố bám dính và độc tố của vi khuẩn E. coli phân lập được
Tăng cường sản sinh yếu tố bám dính bằng phương pháp nuôi cấy E. coli
trên các môi trường chọn lọc. Xác định yếu tố bám dính bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn, tiến hành và đọc kết quả phản ứng theo phương pháp của Difco Laboratories theo Karen W et al, 2000) [56].
- Xác định kháng nguyên bám dính F4 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trực tiếp:
Chuẩn bị hồng cầu gà: Máu gà được lấy vô trùng từ tĩnh mạch cánh, chống đông bằng Citrat Natri 3,8%, rửa hồng cầu bằng cách ly tâm trong dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) ở điều kiện 300 vòng/phút, trong 15 phút, làm liên tục 3 lần rồi chắt bỏ dung dịch rửa còn lại thể tích ban đầu pha thành huyễn dịch 3% với nước muối sinh lý 0,85% để làm phản ứng.
Chuẩn bị kháng nguyên: Chủng vi khuẩn E. coli cần kiểm tra được nuôi
cấy thuần khiết trong môi trường BHI lỏng ở điều kiện 370
C/24h. Canh trùng được ly tâm 2.000 - 3.000 vòng/phút, trong 30 phút, loại bỏ phẩn nước nổi, lấy cặn đem pha loãng (theo dãy so màu Mc Farland) với nước muối sinh lý
0,85% để nồng độ xấp xỉ 5 x 109
CFU/ml. Dịch pha loãng này sẽ được dùng trong phản ứng.
Phản ứng được tiến hành trên 2 bản nhựa 96 giếng đáy tròn, mỗi lần kiểm tra tối đa được 8 chủng. Các bước tiến hành như sau:
+ Dùng micropipette hút nhỏ vào mỗi giếng 25 μl nước muối sinh lý 0,85%. + Pha kháng nguyên đã chuẩn bị theo hệ số 2.
+ Trên bản nhựa số 1 nhỏ thêm 25μl dung dịch đường D - Mannose 0,5% ở tất cả các giếng, bản nhựa số 2 giữ nguyên không cho D - Mannose để phân biệt yếu tố bám dính kháng đường, dạng MRRHA (Mannose Resistant Haemagglutination Adhesion) và dạng mẫn cảm MSHA (Mannose Sensitive Haemagglutination Adhesion) (Nagy. B, Fekete. Pzs, 1999) [61].
+ Cho vào mỗi giếng ở trên cả 2 bản nhựa 25μl huyễn dịch hồng cầu gà đã chuẩn bị, lắc kỹ nhẹ nhàng cho các thành phần trộn đều, sau đó cho vào tủ
lạnh 4 - 80C để bảo quản. Sau 2 giờ đọc kết quả phản ứng
Phản ứng cho kết quả dương tính khi hồng cầu ngưng kết hình dù ở đáy giếng, mức độ ngưng kết được đánh giá theo 3 cấp: +, ++, +++, ++++. Kết quả âm tính khi hồng cầu lắng thành cục, tròn đều như giếng đối chứng.
- Xác định yếu tố bám dính F5, F6, F107 bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo Guinee. P. A. M et al (1976) [49].
Vi khuẩn E. coli được ria cấy trên thạch Minca, bồi dưỡng ở 370C/24h,
làm kháng nguyên xác định F5. Cấy trên môi trường Bromthymol blue agar,
bồi dưỡng ở 370C/24h để xác định F6. Trên môi trường Iso - Sensitest Agar +
0,62% Alizaringell 2G và 0,125% Eosin, bồi dưỡng ở 370C/24h, có 10 - 40%
CO2 để xác định F107. Sau đó tiến hành làm phản ứng ngưng kết trên phiến
kính với kháng huyết thanh F5, F6 và F107 tương tự như phản ứng phát hiện kháng nguyên O.
Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn E. coli (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bằng phản ứng khuếch tán trong da thỏ. Chuẩn bị độc tố:
Chủng vi khuẩn E. coli thuần khiết trên môi trường giữ giống được cấy
chuyển sang 30ml môi trường BHI lỏng đựng trong bình tam giác loại 100ml,
bồi dưỡng có lắc ở điều kiện 370C/24 giờ. Huyễn dịch độc tố thu được bằng
cách li tâm canh trùng 10.000 - 20.000 vòng/phút ở điều kiện lạnh, trong 10 phút. Bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần:
+ Một phần bảo quản ở 40C để thử độc tố không chịu nhiệt.
+ Phần còn lại đun cách thủy ở 800
C trong 10 phút sau đó bảo quản ở điều kiện 40
C, để thử độc tố chịu nhiệt. Chuẩn bị động vật thí nghiệm:
Chọn thỏ khỏe có khối lượng 2,5 - 3 kg, cắt trụi lông ở phần lưng, có thể xoa thêm kem rụng lông để làm sạch hết phần chân lông còn lại, dùng bút dạ chia mảng da này thành những ô vuông nhỏ có kích thước cạnh 2 x 2cm.
Chính giữa mỗi ô vuông, tiêm nội bì 0,1ml dịch độc tố đã được chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm ở 2 ô ở 2 vị trí xa nhau, đối chứng âm là môi trường BHI lỏng vô trùng. Sau khi tiêm 18 giờ với độc tố không chịu nhiệt và sau 2
giờ với độc tố chịu nhiệt, thỏ thí nghiệm được tiêm tĩnh mạch tai dung dịch Evan Blue, liều 40mg/kg thể trọng. Nuôi tiếp 2 giờ, giết thỏ, lột da đọc kết quả phản ứng.
Đọc kết quả phản ứng:
+ Phản ứng dương tính khi ở trên ô vuông thí nghiệm, vùng thẩm xuất
Evan Blue có diện tích ≥ 16mm2 (4 x 4mm).
+ Phản ứng âm tính khi ô vuông trên da thỏ thí nghiệm không có vùng thẩm xuất Evan Blue.
+ Phản ứng được coi là nghi ngờ khi trên ô vuông da thỏ thí nghiệm có
vùng thẩm xuất Evan Blue nhưng diện tích < 16mm2
.