3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4.Xác định một số serotype kháng nguyên Ocủa các chủng phân lập
Sau khi giám định các đặc tính sinh sinh vật, hóa học, chúng tôi đã tiến
hành xác định một số serotype kháng nguyên O của 19 chủng E. coli phân lập
được. Serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli đã được xác định
bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng huyết thanh chuẩn. Kết quả được trình bày tại bảng 3.10.
Kết quả bảng 3.10 cho thấy: có 1/19 chủng kiểm tra dương tính trong phản ứng với kháng huyết thanh O141 chiếm tỷ lệ 5,26%; O138 (5/19 chủng) chiếm 26,32%; O139 (4/19 chủng) chiếm 21,05%; O147, O149 và O8 đều có 2/19 chủng kiểm tra cho kết quả dương tính chiếm 10,53%.
Như vậy, trong số 19 chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù
đầu sau cai sữa tại Thái Bình ngưng kết với kháng huyết thanh O138 chiếm tỷ lệ cao nhất (26,3%); tiếp theo là O139 (21,05%); O8, O147 và O149 đều chiếm tỷ lệ 10,53%, còn serotype O141 chỉ chiếm tỷ lệ 5,5%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Betschinger. H. U, Nielsen. N. O (1992) [39], Nagy. B, Fekete. Pzs (1999) [61].
Nguyễn Khả Ngự (2000) [19] khi phân lập các chủng vi khuẩn E. coli
từ lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long cho biết, trong số 11 serotype kháng nguyên O được xác định, O26 chiếm tỷ lệ cao nhất 27,8%, tiếp theo là O139 chiếm tỷ lệ 13,9%, các serotype O127, O111, O124, O125, O126, O86, O149 đều chiếm tỷ lệ 8,3%, còn serotype O55, O128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%.
Phan Trọng Hổ và cs (2001) [10] đã xác định 3 serotype kháng nguyên O từ các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh ở lợn mắc bệnh phù đầu tại Bình Định là O149, O139, O138. Trong đó, serotype kháng nguyên O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (20%), kế đến là O139 (17,5%), O138 (12,5%).
Tại tỉnh Lâm Đồng, Nguyễn Cảnh Dũng (2011) [3] đã phân lập được 54
chủng vi khuẩn E. coli thuộc 6 serotype kháng nguyên O: O2, O5, O8, O25,
O125, O153; trong đó có 21 chủng thuộc serotype O5 (38,89%), 15 chủng thuộc serotype O25 (27,78%), serotype kháng nguyên O2 & O153 chiếm tỷ lệ là 11,11%; O8 & O125 đều chiếm tỷ lệ 5,56% .
Bảng 3.10. Kết quả xác định serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Huyện
Số lượng chủng
Kết quả xác định serotype kháng nguyên
O141 O8 O138 O139 O147 O149
+ % + % + % + % + % + %
1 Hưng Hà 6 1 16.67 1 16.67 2 33.33 1 16.67 0 0 1 16.67
2 Kiến Xương 7 0 0 0 0 1 14.29 2 28.57 1 14.29 0 0
3 Thái Thụy 6 0 0 1 16.67 2 33.33 1 16.67 1 16.67 1 16.67
53
Như vậy, các serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli gây bệnh
phù đầu lợn sau cai sữa tại Thái Bình cũng thuộc các serotype kháng nguyên O chính gây bệnh phù đầu mà các tác giả trong và ngoài nước đã xác định. Tuy nhiên, mỗi vùng có vị trí địa lý khác nhau thì có các serotype kháng
nguyên O của vi khuẩn E. coli cũng có sự khác nhau. Điều này đã tạo ra sự đa
dạng về tính kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gây bệnh. Việc chọn các
chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Thái Bình
để chế tạo auto – vaccine sẽ có hiệu quả phòng bệnh tốt đối với bệnh phù đầu tại tỉnh Thái Bình.
3.5. Xác định yếu tố bám dính của chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
Đã tiến hành xác định các yếu tố bám dính của chủng vi khuẩn E. coli (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Thái Bình. Yếu tố bám dính F4 xác định bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trực tiếp. Yếu tố bám dính F5, F6 và F107 được xác định bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính. Kết quả trình bày ở bảng 3.11
Bảng 3.11. Kết quả xác định yếu tố bám dính của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc STT Huyện Số lượng chủng Kết quả xác định yếu tố bám dính F4 F107 F5 F6 + % + % + % + % 1 Hưng Hà 6 2 33.33 1 16.67 2 33.33 1 16.67 2 Kiến Xương 7 3 42.86 2 28.57 2 28.57 0 0 3 Thái Thụy 6 2 33.33 2 33.33 2 33.33 0 0 Cộng 19 7 36.84 5 26.32 6 31.58 1 5.26
Từ bảng 3.11 các kết quả thu được cho thấy: E. coli phân lập được từ
lợn mắc bệnh phù đầu ởThái Bình mang yếu tố bám dính F4 chiếm tỷ lệ cao nhất là 36,84%; F5 (31,58%), F107 (26,32%); và F6 (5,26%). Kết quả nghiên
54
Theo Trịnh Quang Tuyên (2006) [35] kết quả xác định yếu tố bám dính của các chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phân trắng lợn con ở một số tỉnh phía Bắc cho thấy các chủng E. coli mang yếu tố bám dính F4 chiếm tỷ lệ 7,8%, yếu tố bám dính F5 chiếm 15,6%, yếu tố bám dính F6 chiếm 23,4% và F18 chiếm 4,6%. Như vậy, tỷ lệ các yếu tố bám dính của vi
khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn có sự khác nhau.
3.6. Xác định khả năng gây dung huyết của chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc lập đƣợc
Các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu của
03 huyện Hưng Hà, Kiến Xương và Thái Thụy được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết theo α, β, γ. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Huyện lượng Số chủng
Kết quả xác định khả năng gây dung huyết
α β γ (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 Hưng Hà 6 4 66.67 2 33.33 0 0 2 Kiến Xương 7 5 71.43 1 14.29 1 14.29 3 Thái Thụy 6 3 50.00 1 16.67 2 33.33 Tính chung 19 12 63.16 5 21.05 3 15.79
Từ bảng 3.12, kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng
E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu ở 03 huyện cho thấy:
- Huyện Hưng Hà: có 4/6 chủng vi khuẩn E. coli gây dung huyết trên
55
- Huyện Kiến Xương: có 5/7 chủng vi khuẩn gây dung huyết theo kiểu α chiếm tỷ lệ 71,43%, dung huyết theo kiểu β (14,29%); có14,29% chủng không gây dung huyết.
- Huyện Thái Thụy: có 3/6 chủng vi khuẩn gây dung huyết theo kiểu α chiếm tỷ lệ 50%, 1/6 chủng (16,67%) gây dung huyết theo kiểu β; 2/6 chủng (33,33%) không gây dung huyết.
Trong tổng số 19 chủng được xác định khả năng gây dung huyết có 63,16% số chủng E. coli gây dung huyết kiểu α; dung huyết kiểu β chiếm 21,05% và 15,79% chủng không gây dung huyết.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lan (2003) [12] khi xác định khả năng gây dung huyết của
các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu lợn ở Thái Nguyên và Bắc Giang.
Trong đó có 67,31% số chủng E. coli ở Thái Nguyên và 77,78% số chủng E.
coli ở Bắc Giang gây dung huyết kiểu α là 28,85% và 22,22% gây dung huyết
kiểu β.
Khi nghiên cứu vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu sau cai sữa, nhiều tác giả thường xem khả năng gây dung huyết là một chỉ tiêu để xác định vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu. Tuy nhiên, theo Bùi Lưu Ly và cs (2007)
[16] khi nghiên cứu vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu và lợn
con bị tiêu chảy đều có khả năng gây dung huyết. Trong đó có 3/24 mẫu vi
khuẩn E. coli phân lập được chiếm 12,5% không mang gen VT2e và F18 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhưng cho kết quả dung huyết dương tính. Như vậy, rõ ràng khả năng gây dung huyết không phải là đặc tính sinh học đặc trưng và không thể sử dụng
tính chất này làm yếu tố tham khảo trong chẩn đoán vi khuẩn E. coli gây bệnh
phù đầu ở lợn con sau cai sữa.
3.7. Xác định khả năng sản sinh độc tố đƣờng ruột của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
56
Các loại độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt đóng vai trò quan trọng
trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn E. coli gây bệnh. Chúng tôi đã tiến hành
xác định độc tố đường ruột (ST, LT) bằng phương pháp khuếch tán trên da thỏ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Huyện Số lượng (n) Khả năng sản sinh độc tố ST LT ST + LT + % + % + % 1 Hưng Hà 6 3 50 2 33.33 1 16.67 2 Kiến Xương 7 4 57.14 3 42.86 0 0 3 Thái Thụy 6 3 50 2 33.33 1 16.67 Tính chung 19 10 52.63 7 36.84 2 10.53
Kết quả bảng 3.13 cho thấy: có 10/19 chủng sản sinh độc tố đường ruột chịu nhiệt ST (52,63%), 7/19 chủng sản sinh độc tố đường ruột không chịu nhiệt LT (36,84%), tỷ lệ các chủng E. coli mang cả 2 độc tố ST + LT là 10,53% với 2/19 chủng. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt
và không chịu nhiệt một lần nữa khẳng định độc tố của vi khuẩn E. coli phân
lập được từ lợn mắc bệnh.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khác so với kết quả xác định độc tố
đường ruột của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu
tại Nam Định, Hưng Yên, Hà Nội có 6/10 chiếm tỷ lệ 60% chủng kiểm tra sản sinh cả 2 loại độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt, 4/10 chủng (40%) còn lại không sản sinh độc tố đường ruột (theo Lê Văn Lãnh và cs, 2008) [15].
Theo Trịnh Quang Tuyên (2006) [35], các chủng E. coli gây bệnh phù đầu ở lợn 22 - 60 ngày tuổi sản sinh ST (57,6%), LT (43,4%), và ST + LT (44,6%). Tuy nhiên, theo Nguyễn Xuân Hòa và cs (2009) [9] xác định các gen
57
tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen LT cao nhất (25/61) chiếm 40,98%, kế tiếp là
vi khuẩn E. coli mang gen STb (17/61) chiếm 27,87% và vi khuẩn E. coli
mang gen STa (9/61) chiếm 14,75%, sau cùng là vi khuẩn E. coli mang gen
sản sinh độc tố dung huyết E. coli 6/61 chiếm 19,84%. Như vậy, các chủng vi
khuẩn E. coli gây phù đầu và tiêu chảy ở lợn sản sinh độc tố đường ruột chịu
nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT) có tỷ lệ khác nhau. Vi khuẩn E. coli gây
bệnh phù đầu có thể tiết nội độc tố và độc tố verotoxin. Nội độc tố và độc tố verotoxin cùng xâm nhập vào trong máu gây nên các triệu chứng sốc nặng trên lợn thí nghiệm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) [7].
Theo Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) [34] kết quả phân tích sự có mặt của các gen quy định độc lực cũng như tổ hợp của các gen khác nhau trên cùng 1 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy tại tỉnh Phú Thọ bằng phản ứng multilex PCR cho thấy có tới 39/74 chủng (chiếm 56,5%) mang cả 2 loại độc tố enterotoxin và verotoxin.
Điều này giải thích nguyên nhân lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa có biểu hiện triệu chứng tiêu chảy
3.8. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập
Đã tiến hành thử độc lực của 19 chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc
bệnh phù đầu của các huyện Hưng Hà, Kiến Xương, Thái Thụy tỉnh Thái (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bình. Bằng cách tiêm canh khuẩn đã được bồi dưỡng 24h/370C cho mỗi
chủng cần nghiên cứu 02 chuột thí nghiệm với liều tiêm xoang bụng là 0,2ml/chuột thí nghiệm. Theo dõi số lượng chuột chết tại các thời điểm sau 8h, 24h, 32h, 48h và sau 6 ngày.
Kết quả được quả trình bày ở bảng 3.14 cho thấy:
Bảng 3.14. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập
STT Huyện Số
lượng chuột Số Liều tiêm
Thời gian theo dõi và số chuột chết (con)
Tỷ lệ chết
58 chủng thử (con) xoang bụng (ml) Sau 8h Sau 24h Sau 32h Sau 48h Sau 6 ngày (%) 1 Hưng Hà 6 12 0.2 0 6 4 0 0 83.33 2 Kiến Xương 7 14 0.2 2 6 4 2 0 100 3 Thái Thụy 6 12 0.2 0 4 2 2 0 66.67 Cộng 19 38 0.2 2 16 10 4 0 84.21
Kết quả bảng 3.14 cho thấy: có 2/38 chuột chết chiếm 5,26% sau khi tiêm trong vòng 8h; sau khi tiêm 24h có 16/38 chuột chết (42,11%) sau khi tiêm 24h; có 10/38 chuột (26,32%) chết sau khi tiêm 32h; có 4/38 chuột (10,53%) chết sau khi tiêm 48h. Không có con chuột nào chết sau 6 ngày tiêm.
Như vậy, 19 chủng E. coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Thái
Bình được thử độc lực trên 38 chuột thí nghiệm đã gây chết 32/38 chuột chiếm tỷ lệ 84,2% chuột thí nghiệm trong vòng 48h sau khi công cường độc. Kết quả
này phù hợp với kết quả thử độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được từ lợn
mắc bệnh phù đầu của Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo và cs (1994) [21]; Lê Văn
Lãnh và cs (2008) [15] khi kiểm tra độc lực của 10 chủng vi khuẩn E. coli phân
lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Nam Định, Hà Nội, Hưng Yên trên chuột thí nghiệm có 9/10 chủng (90%) gây chết chuột thí nghiệm.
Các chuột chết đều được mổ khám để kiểm tra triệu chứng, bệnh tích và đều quan sát thấy các bệnh tích điển hình như: bụng chướng to, chướng hơi đường tiêu hóa, phổi viêm sưng, xuất huyết, gan tụ huyết, ruột xuất huyết. Lấy máu tim, ria cấy trên đĩa thạch máu, thạch MacConkey đều phân lập lại được vi khuẩn thuần khiết từ máu tim. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập được đều có độc lực cao và là nguyên nhân quan trọng gây bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa.
3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dƣợc của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
Để điều trị bệnh phù đầu có hiệu quả cao hơn, chúng tôi đã tiến hành thử khả năng mẫn cảm của 19 chủng vi khuẩn E. coli phân lập được với 10 loại
59
kháng sinh khác nhau bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dƣợc của vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
STT Tên kháng sinh & hóa dược
Số chủng thử Đánh giá độ mẫn cảm Rất mẫn cảm Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc + % + % + % 1 Ceftazidime (Ce) 6 5 83.33 1 16.67 0 0 2 Colistin (Co) 6 3 50 2 33.33 1 16.67 3 Gentamicin (Ge) 6 3 50 1 16.67 2 33.33 4 Amoxicillin (Ac) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 5 Neomycin (N50) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 6 Norfloxacin (No) 6 4 66.67 1 16.67 1 16.67 7 Spectinomycin (Se) 6 3 50 1 16.67 2 33.33 8 Sulfamethoxazole (S3) 6 2 33.33 3 50 1 16.67 9 Tetracyclin (Te) 6 1 16.67 2 33.33 3 50 10 Kanamycin (Kn) 6 3 50 2 33.33 1 16.67 Tính chung 60 32 53.33 15 25 13 21.67
Từ bảng 3.15, các kết quả thu được cho thấy:
- Các chủng E. coli phân lập được mẫn cảm mạnh với kháng sinh
Ceftazidime đạt tỷ lệ 83,33%; mẫn cảm bởi Amoxicillin, Norfloxacin và Neomycin chiếm 66,67%.
- Một số loại kháng sinh như Colistin, Gentamicin, Spectinomycin và Kanamycin có tỷ lệ mẫn cảm đạt 50%.
60 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
các chủng vi khuẩn E. coli kháng với Colistin, Amoxicilin, Norfloxacin,
Sulfamethoxazole và Kanamycin.
Một số kết quả nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của các chủng E.
coli gây bệnh phù đầu như sau:
Bùi Xuân Đồng (2002) [5] tiến hành thử kháng sinh đồ với các chủng
vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Hải Phòng mẫn cảm với
Chloramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin.
Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [14] thử kháng sinh đồ với các loại kháng sinh Cefuroxime, Akamicin, Doxycycline, Ampicilin với các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập từ lợn mắc bệnh phù đầu ở Thái Nguyên và Bắc Giang cho thấy: vi khuẩn E. coli rất mẫn cảm với kháng sinh Akamicin, yếu hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime.
Tính kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng có
xu hướng tăng theo thời gian sử dụng, nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc là do sử dụng kháng sinh không đúng kỹ thuật của con người, gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong Plasmid R (Resitance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp.
Vì vậy, một số loại kháng sinh có tác dụng mạnh như Ceftazidime là