Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Theo Theo Bertschinger. H. U, Nielsen. N. O (1992) [39], bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa với các dấu hiệu điển hình của bệnh là phù mặt và có triệu chứng thần kinh. Tỷ lệ lợn bị bệnh chết từ 40 - 100%, những con to béo nhất đàn, ăn no nhất thường bị chết. Lợn bệnh bị sốt 1 - 2 ngày đầu nhiễm bệnh sau đó hạ xuống có khi dưới mức bình thường. Lợn bệnh bị sưng đầu, mí mắt, nên có con bị lồi mắt ra. Bị sưng hầu nên lợn bệnh giảm tiếng kêu, khó thở. Lợn bệnh có triệu chứng thần kinh như đi xoay vòng theo một chiều nhất định, yếu hai chân sau nên nằm co giật, bốn chân giãy liên tục hoặc thẳng cứng trước khi chết. Khi mổ ra thấy ruột non chứa đầy chất lỏng và khí căng phồng, quan sát từ bên ngoài thấy đoạn thì thâm đen hoặc đỏ đen, đoạn thì trắng bệch. Đây là bệnh tích điển hình lợn mắc bệnh sưng phù đầu.

Xoang ngực và xoang bao tim có nhiều dịch fibrin, sưng phù ở mức độ khác nhau trên hai lá phổi. Tim có xuất huyết ở cơ và màng bao tim. Sưng phù ở lớp dưới niêm mạc dạ dày được thể hiện trong vùng viêm ở phần thân vị. Nó có thể khác nhau từ chỗ rất khó thấy cho đến có độ dầy 2cm hoặc lớn hơn. Nếu trường hợp nặng thì hiện tượng sưng phù có thể tận tới lớp cơ. Sưng phù có thể đánh giá tốt nhất bằng cách kiểm tra thanh mạc và áo cơ ở đường cong lớn. Chất dịch sưng phù này thường là huyết thanh đông.

Sưng phù túi mật đôi khi có thể thấy, đó là dấu hiệu của nội độc tố tác động. Màng treo kết tràng là nơi phổ biến cho bệnh sưng phù, đôi khi một đoạn ruột non hay trực tràng có biểu hiện sưng phù lớp dưới niêm mạc. Các trường hợp thực nghiệm, lớp dưới niêm mạc của manh tràng khác nhau ở bề ngoài từ bình thường cho đến sưng, xuất huyết.

Bệnh tích vi thể: Bệnh tích vi thể quan trọng nhất là chứng thoái hóa mạch máu ảnh hưởng đến động mạch nhỏ. Tổn thương có thể ở nhiều cơ quan và mô. Mạng lưới động mạch bên cạnh màng treo kết tràng, bên cạnh hạch bạch huyết kết tràng luôn bị ảnh hưởng.

Tổn thương cấp tính sớm nhất là hoại tử tế bào cơ. Một số mạch máu có thể bị ảnh hưởng với sự thâm nhiễm fibrin. Tổn thương mạch máu khó phát hiện ở thể cấp tính, nhưng ở những con còn sống sót thì tổn thương này khá rõ ràng.

Lợn đã hồi phục sau bệnh hoặc sống sót vài ngày có dấu hiệu tổn thương ở não, dây thần kinh, tiểu động mạch. Những dấu hiệu này là kết quả của tổn thương mạch máu dẫn đến phù và thiếu máu cục bộ. Trong các trường hợp bệnh cấp tính có chứng phù mạch màng não, mềm xung quanh mạch máu.

Theo Bertschinger. H. U, Nielsen. N. O (1992) [39], Markku Johansen et

al (1997) [58], các type E. coli O138, O139, O141 gây bệnh phù đầu lợn sau

cai sữa thường sản xuất độc tố Verotoxin (VT) và mang yếu tố bám dính F18.

Schierak và cs (2006) [64] cho biết có 68,6% chủng E. coli phân lập từ

lợn khỏe mang ít nhất một gen mã hóa độc tố đường ruột chịu nhiệt typ I & II, độc tố đường ruột không chịu nhiệt typ I cũng như độc tố Shiga toxin 2e và yếu tố bám dính F4, F5, F6, F8 và F41.

Markku Johansen et al (1997) [58] và Bosworth. B. T và cs (1996) [40]

phòng cho lợn con 1 - 2 tuần tuổi. Thí nghiệm được tiến hành trên 2 lô thí nghiệm có sử dụng vắc xin và không sử dụng vắc xin, sau đó gây nhiễm trên

cả 2 lô thí nghiệm (giai đoạn 21 - 28 ngày tuổi) bằng canh khuẩn E. coli sản

xuất VT2e. Kết quả lô thí nghiệm không sử dụng vắc xin lợn mắc bệnh phù đầu với triệu chứng điển hình: hoại tử mạch máu, giảm tăng trọng, mất thăng bằng, phù mi, chết; lợn được tiêm phòng không gây phản ứng phụ, tỷ lệ mắc bệnh phù đầu giảm, có tác dụng tạo ra kháng thể chống lại bệnh phù đầu.

Docic M, Bilkei G (2006) [44] cũng đã chế tạo vắc xin vô hoạt từ các

chủng E. coli sản xuất VT2e. Thí nghiệm tiến hành tại trại lợn có tỷ lệ lợn

mắc bệnh phù đầu sau cai sữa cao. Nhóm 1 (n = 351) sử dụng vắc xin cho lợn con 1 tuần tuổi với liều lượng 12,5 microgram, tiêm nhắc lại lúc 3 tuần tuổi với liều lượng 25 microgram. Nhóm 2 (n =350) không sử dụng vắc xin. Kết quả thí nghiệm cho thấy:

+ Tỷ lệ tăng trọng trung bình (301 ± 31g/ngày) và 278 ±41g/ngày) + Tỷ lệ tử vong do phù đầu giảm 0,9% so với 6,9%

+ Tăng trọng trong giai đoạn vỗ béo đến 4 tháng tuổi không có sự khác biệt giữa các nhóm: 711 ± 41g so với 708 ± 40g.

Chƣơng 2

NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U

2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Lợn con sau cai sữa nuôi tại các huyện, của tỉnh Thái Bình - Vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu ở lợn.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

- Địa bàn nghiên cứu : Các trại lợn chăn nuôi theo hình thức công nghiệp tập trung trên địa bàn tỉnh Thái Bình.

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên .

2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2010 - 12/ 2011.

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình Thái Bình

2.1.1.1. Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu trong các năm 2008, 2009, 2010 2.1.1.2. Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo địa điểm

2.1.1.3. Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo mùa 2.1.1.3. Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo tuổi 2.1.1.4. Tình hình lợn chết do mắc bệnh phù đầu

2.2.2. Phân lập vi khuẩn E. coli từ những lợn mắc bệnh phù đầu

2.2.2.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh

2.2.2.2. Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được

2.2.2.3. Xác định yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập được

+ Xác định type kháng nguyên O + Xác định yếu tố bám dính + Xác định yếu tố dung huyết

+ Xác định khả năng sản sinh độc tố

2.2.2.4. Thử độc lực của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được

2.2.2.5. Thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được

2.2.3. Chế tạo auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

- Chọn chủng E. coli chế tạo vắc xin

- Kiểm tra, đánh giá auto - vaccine trong phòng thí nghiệm - Thử nghiệm auto - vaccine trên lợn thí nghiệm

- Khảo sát đáp ứng miễn dịch của lợn thí nghiệm sử dụng auto - vaccine.

2.3. Vật liệu nghiên cứu

- Môi trường, hóa chất thông dụng đạt tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) của

Merck được chọn lọc để sử dụng phân lập và giám định vi khuẩn E. coli, chế

tạo và kiểm nghiệm vắc xin tại chỗ.

- Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn phân lập được. - Động vật thí nghiệm

Chuột bạch khỏe 22 - 25gr/con; thỏ khỏe 2,5 - 3 kg/con.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh, 2001) [29]; Nguyễn Văn Thiện, 1997) [31].

- Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn theo Dirk U. Pfeiffer (2002) [45].

Phương pháp phân tích dịch tễ:

Để so sánh nguy cơ mắc bệnh phù đầu và chết do bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa theo lứa tuổi, mùa vụ, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR).

Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [29] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các nguy cơ so sánh và được định nghĩa là nguy cơ phát triển một bệnh trong số các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được so sánh với nguy cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó.

Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng, số liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:

Khai thác sau khi chọn Chủ động chọn vào nghiên cứu Bệnh trạng Cộng Có Không

Cảm nhiễm khi tiếp xúc với nguy cơ

Có a b a + b

Không c d c +d

Cộng a+c b+d a +b+c+d

Trong đó:

a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc

d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc Nguy cơ tương đối được tính theo công thức:

RR= Ie = a/(a+b)

Trong đó:

Ie là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ. Đánh giá kết qủa:

+ Nếu RR >1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh.

+ RR= 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau. + RR <1 nói lên một kết hợp âm tính.

* Dùng khi bình phương (χ2) so sánh tần suất bệnh:

Theo công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[]: χ2 TN = (ad - bc) 2 (a+b+c+d) (a+b) (c+d) (a+c) (b+d) Tìm giá trị χ2α ứng với độ tự do υ = (l1 -1) (l2 -1) = (2-1) (2-1) =1 Ta tìm được các giá trị χ2 α = 3,8; 6,6; 10,8 với mức α = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cách tra bảng. So sánh χ2TN và χ2

α để tìm xác suất xuất hiện giá trị χ2TN hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra.

Đánh giá kết quả: + Nếu χ2

TN < χ2

α tức P > 0,05 thì kết luận không có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ. + Nếu χ2

TN > χ2

α tức P <0,05 thì kết luận có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ ở mức α.

2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn.

* Thu thập mẫu

Lấy mẫu bệnh phẩm, phân lập và giám định vi khuẩn E. coli theo Quinn. P. J et al, 1994) [63].

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập giám định vi khuẩn E. coli

(Theo Quinn. P. J et al, 1994) [63].

Phƣơng pháp nhuộm Gram: Các bước nhuộm:

+ Nhỏ một giọt nước sinh lý.

+ Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít khuẩn lạc (bằng đầu tăm dàn đều lên phiến kính, rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn (giữ khoảng cách sao cho vi khuẩn không bị cháy thành than).

+ Nhỏ một giọt tím Genxian, để 1 phút sau đó rửa nhẹ bằng nước sau đó để khô hoặc hơ khô.

+ Nhỏ 1 giọt Lugol (gắn màu) để một phút.

+ Tẩy nhanh bằng cồn 700C trong 15 giây rồi rửa ngay bằng nước, sau

đó thấm bông.

+ Nhỏ một giọt dung dịch đỏ Fucsin giữ trong 2 phút rồi rửa nhẹ bằng nước, để khô tự nhiên.

MacConkey Agar 440C/24h

- Nutrient broth Kiểm tra sản sinh Indole - TSI agar Kiểm tra sinh hơi, sản sinh H2S - Blood agar Kiểm tra khả năng dung huyết - Nhuộm Gram Kiểm tra hình thái

Mẫu bệnh phẩm (máu tim, gan, não svv…

Brillant Green Bile Agar 440C/24h XLD Agar 370C/24h - Xác định type O - Xác định yếu tố bám dính - Xác định độc tố

+ Soi kính: Dùng dầu xilen lau kính, nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính rồi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần.

2.4.3. Xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được

Vi khuẩn E. coli có nhiều serotyp e khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotyp e O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng huyết thanh đơn giá trong

nhóm cần xác đ ịnh. Xác định một số serotype kháng nguyên O của vi khuẩn

E. coli phân lập được theo Karen. W et al (2000) [56].

Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp e gồm: + Các chủng E. coli cần định type được giữ trên thạch máu .

+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá ), dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85%, phiến kính sạch.

* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:

Phản ứng được thực hiện trên phiến kính, tiến hành chia phiến kính làm 3 phần. Trên một đầu của phiến kính ta nhỏ giọt nước muối sinh lý làm đối chứng âm, phần còn lại chia làm 2, mỗi vị trí nhỏ một giột kháng huyết thanh

nhóm (Poly O). Dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng khuẩn lạc chủng E. coli

cần giám định hòa trộn đều với một giọt kháng huyết thanh, làm như vậy đối với giọt nước muối sinh lý. Để 1 - 2 phút đọc kết quả phản ứng.

+ Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++ (theo Difco Laboratories).

+ Phản ứng âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều tương tự như bên đối chứng.

Các chủng có ngưng kết với nhóm kháng nguyên O đa giá, sẽ tiếp tục làm phản ứng ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá có trong nhóm đa giá đó, cách làm và theo dõi tương tự như phản ứng kháng huyết thanh nhóm Poly O ở trên. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2 rồi tiếp tục làm phản ứng. Nhóm serotype kháng huyết thanh nào có phản ứng ngưng kết xảy ra ở độ pha loãng cao nhất với chủng vi khuẩn giám định, chủng vi khuẩn thuộc về serotype đó.

2.4.4. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được E. coli phân lập được

2.4.4.1. Xác định khả năng gây dung huyết

Vi khuẩn E. coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu

cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết:

+ Dung huyết kiểu β: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng. + Dung huyết kiểu α: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết mờ, sau đó tiếp tục để ở nhiệt độ 370

C trong 18 giờ, thấy có vòng dung huyết sáng sạch.

+ Dung huyết kiểu γ: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết hay vi khuẩn không có khả năng gây dung huyết.

2.4.4.2. Xác định yếu tố bám dính và độc tố của vi khuẩn E. coli phân lập được

Tăng cường sản sinh yếu tố bám dính bằng phương pháp nuôi cấy E. coli

trên các môi trường chọn lọc. Xác định yếu tố bám dính bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn, tiến hành và đọc kết quả phản ứng theo phương pháp của Difco Laboratories theo Karen W et al, 2000) [56].

- Xác định kháng nguyên bám dính F4 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trực tiếp:

Chuẩn bị hồng cầu gà: Máu gà được lấy vô trùng từ tĩnh mạch cánh, chống đông bằng Citrat Natri 3,8%, rửa hồng cầu bằng cách ly tâm trong dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) ở điều kiện 300 vòng/phút, trong 15 phút, làm liên tục 3 lần rồi chắt bỏ dung dịch rửa còn lại thể tích ban đầu pha thành huyễn dịch 3% với nước muối sinh lý 0,85% để làm phản ứng.

Chuẩn bị kháng nguyên: Chủng vi khuẩn E. coli cần kiểm tra được nuôi

cấy thuần khiết trong môi trường BHI lỏng ở điều kiện 370

C/24h. Canh trùng được ly tâm 2.000 - 3.000 vòng/phút, trong 30 phút, loại bỏ phẩn nước nổi,