3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Môi trường, hóa chất thông dụng đạt tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) của
Merck được chọn lọc để sử dụng phân lập và giám định vi khuẩn E. coli, chế
tạo và kiểm nghiệm vắc xin tại chỗ.
- Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn phân lập được. - Động vật thí nghiệm
Chuột bạch khỏe 22 - 25gr/con; thỏ khỏe 2,5 - 3 kg/con.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh, 2001) [29]; Nguyễn Văn Thiện, 1997) [31].
- Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn theo Dirk U. Pfeiffer (2002) [45].
Phương pháp phân tích dịch tễ:
Để so sánh nguy cơ mắc bệnh phù đầu và chết do bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa theo lứa tuổi, mùa vụ, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR).
Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [29] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các nguy cơ so sánh và được định nghĩa là nguy cơ phát triển một bệnh trong số các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được so sánh với nguy cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó.
Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng, số liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:
Khai thác sau khi chọn Chủ động chọn vào nghiên cứu Bệnh trạng Cộng Có Không
Cảm nhiễm khi tiếp xúc với nguy cơ
Có a b a + b
Không c d c +d
Cộng a+c b+d a +b+c+d
Trong đó:
a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc
d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc Nguy cơ tương đối được tính theo công thức:
RR= Ie = a/(a+b)
Trong đó:
Ie là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ. Đánh giá kết qủa:
+ Nếu RR >1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh.
+ RR= 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau. + RR <1 nói lên một kết hợp âm tính.
* Dùng khi bình phương (χ2) so sánh tần suất bệnh:
Theo công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[]: χ2 TN = (ad - bc) 2 (a+b+c+d) (a+b) (c+d) (a+c) (b+d) Tìm giá trị χ2α ứng với độ tự do υ = (l1 -1) (l2 -1) = (2-1) (2-1) =1 Ta tìm được các giá trị χ2 α = 3,8; 6,6; 10,8 với mức α = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cách tra bảng. So sánh χ2TN và χ2
α để tìm xác suất xuất hiện giá trị χ2TN hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra.
Đánh giá kết quả: + Nếu χ2
TN < χ2
α tức P > 0,05 thì kết luận không có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ. + Nếu χ2
TN > χ2
α tức P <0,05 thì kết luận có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ ở mức α.
2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn.
* Thu thập mẫu
Lấy mẫu bệnh phẩm, phân lập và giám định vi khuẩn E. coli theo Quinn. P. J et al, 1994) [63].
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập giám định vi khuẩn E. coli
(Theo Quinn. P. J et al, 1994) [63].
Phƣơng pháp nhuộm Gram: Các bước nhuộm:
+ Nhỏ một giọt nước sinh lý.
+ Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít khuẩn lạc (bằng đầu tăm dàn đều lên phiến kính, rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn (giữ khoảng cách sao cho vi khuẩn không bị cháy thành than).
+ Nhỏ một giọt tím Genxian, để 1 phút sau đó rửa nhẹ bằng nước sau đó để khô hoặc hơ khô.
+ Nhỏ 1 giọt Lugol (gắn màu) để một phút.
+ Tẩy nhanh bằng cồn 700C trong 15 giây rồi rửa ngay bằng nước, sau
đó thấm bông.
+ Nhỏ một giọt dung dịch đỏ Fucsin giữ trong 2 phút rồi rửa nhẹ bằng nước, để khô tự nhiên.
MacConkey Agar 440C/24h
- Nutrient broth Kiểm tra sản sinh Indole - TSI agar Kiểm tra sinh hơi, sản sinh H2S - Blood agar Kiểm tra khả năng dung huyết - Nhuộm Gram Kiểm tra hình thái
Mẫu bệnh phẩm (máu tim, gan, não svv…
Brillant Green Bile Agar 440C/24h XLD Agar 370C/24h - Xác định type O - Xác định yếu tố bám dính - Xác định độc tố
+ Soi kính: Dùng dầu xilen lau kính, nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính rồi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần.
2.4.3. Xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được
Vi khuẩn E. coli có nhiều serotyp e khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotyp e O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng huyết thanh đơn giá trong
nhóm cần xác đ ịnh. Xác định một số serotype kháng nguyên O của vi khuẩn
E. coli phân lập được theo Karen. W et al (2000) [56].
Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp e gồm: + Các chủng E. coli cần định type được giữ trên thạch máu .
+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá ), dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85%, phiến kính sạch.
* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:
Phản ứng được thực hiện trên phiến kính, tiến hành chia phiến kính làm 3 phần. Trên một đầu của phiến kính ta nhỏ giọt nước muối sinh lý làm đối chứng âm, phần còn lại chia làm 2, mỗi vị trí nhỏ một giột kháng huyết thanh
nhóm (Poly O). Dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng khuẩn lạc chủng E. coli
cần giám định hòa trộn đều với một giọt kháng huyết thanh, làm như vậy đối với giọt nước muối sinh lý. Để 1 - 2 phút đọc kết quả phản ứng.
+ Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++ (theo Difco Laboratories).
+ Phản ứng âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều tương tự như bên đối chứng.
Các chủng có ngưng kết với nhóm kháng nguyên O đa giá, sẽ tiếp tục làm phản ứng ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá có trong nhóm đa giá đó, cách làm và theo dõi tương tự như phản ứng kháng huyết thanh nhóm Poly O ở trên. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2 rồi tiếp tục làm phản ứng. Nhóm serotype kháng huyết thanh nào có phản ứng ngưng kết xảy ra ở độ pha loãng cao nhất với chủng vi khuẩn giám định, chủng vi khuẩn thuộc về serotype đó.
2.4.4. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được E. coli phân lập được
2.4.4.1. Xác định khả năng gây dung huyết
Vi khuẩn E. coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu
cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết:
+ Dung huyết kiểu β: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng. + Dung huyết kiểu α: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết mờ, sau đó tiếp tục để ở nhiệt độ 370
C trong 18 giờ, thấy có vòng dung huyết sáng sạch.
+ Dung huyết kiểu γ: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết hay vi khuẩn không có khả năng gây dung huyết.
2.4.4.2. Xác định yếu tố bám dính và độc tố của vi khuẩn E. coli phân lập được
Tăng cường sản sinh yếu tố bám dính bằng phương pháp nuôi cấy E. coli
trên các môi trường chọn lọc. Xác định yếu tố bám dính bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn, tiến hành và đọc kết quả phản ứng theo phương pháp của Difco Laboratories theo Karen W et al, 2000) [56].
- Xác định kháng nguyên bám dính F4 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trực tiếp:
Chuẩn bị hồng cầu gà: Máu gà được lấy vô trùng từ tĩnh mạch cánh, chống đông bằng Citrat Natri 3,8%, rửa hồng cầu bằng cách ly tâm trong dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) ở điều kiện 300 vòng/phút, trong 15 phút, làm liên tục 3 lần rồi chắt bỏ dung dịch rửa còn lại thể tích ban đầu pha thành huyễn dịch 3% với nước muối sinh lý 0,85% để làm phản ứng.
Chuẩn bị kháng nguyên: Chủng vi khuẩn E. coli cần kiểm tra được nuôi
cấy thuần khiết trong môi trường BHI lỏng ở điều kiện 370
C/24h. Canh trùng được ly tâm 2.000 - 3.000 vòng/phút, trong 30 phút, loại bỏ phẩn nước nổi, lấy cặn đem pha loãng (theo dãy so màu Mc Farland) với nước muối sinh lý
0,85% để nồng độ xấp xỉ 5 x 109
CFU/ml. Dịch pha loãng này sẽ được dùng trong phản ứng.
Phản ứng được tiến hành trên 2 bản nhựa 96 giếng đáy tròn, mỗi lần kiểm tra tối đa được 8 chủng. Các bước tiến hành như sau:
+ Dùng micropipette hút nhỏ vào mỗi giếng 25 μl nước muối sinh lý 0,85%. + Pha kháng nguyên đã chuẩn bị theo hệ số 2.
+ Trên bản nhựa số 1 nhỏ thêm 25μl dung dịch đường D - Mannose 0,5% ở tất cả các giếng, bản nhựa số 2 giữ nguyên không cho D - Mannose để phân biệt yếu tố bám dính kháng đường, dạng MRRHA (Mannose Resistant Haemagglutination Adhesion) và dạng mẫn cảm MSHA (Mannose Sensitive Haemagglutination Adhesion) (Nagy. B, Fekete. Pzs, 1999) [61].
+ Cho vào mỗi giếng ở trên cả 2 bản nhựa 25μl huyễn dịch hồng cầu gà đã chuẩn bị, lắc kỹ nhẹ nhàng cho các thành phần trộn đều, sau đó cho vào tủ
lạnh 4 - 80C để bảo quản. Sau 2 giờ đọc kết quả phản ứng
Phản ứng cho kết quả dương tính khi hồng cầu ngưng kết hình dù ở đáy giếng, mức độ ngưng kết được đánh giá theo 3 cấp: +, ++, +++, ++++. Kết quả âm tính khi hồng cầu lắng thành cục, tròn đều như giếng đối chứng.
- Xác định yếu tố bám dính F5, F6, F107 bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo Guinee. P. A. M et al (1976) [49].
Vi khuẩn E. coli được ria cấy trên thạch Minca, bồi dưỡng ở 370C/24h,
làm kháng nguyên xác định F5. Cấy trên môi trường Bromthymol blue agar,
bồi dưỡng ở 370C/24h để xác định F6. Trên môi trường Iso - Sensitest Agar +
0,62% Alizaringell 2G và 0,125% Eosin, bồi dưỡng ở 370C/24h, có 10 - 40%
CO2 để xác định F107. Sau đó tiến hành làm phản ứng ngưng kết trên phiến
kính với kháng huyết thanh F5, F6 và F107 tương tự như phản ứng phát hiện kháng nguyên O.
Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn E. coli
bằng phản ứng khuếch tán trong da thỏ. Chuẩn bị độc tố:
Chủng vi khuẩn E. coli thuần khiết trên môi trường giữ giống được cấy
chuyển sang 30ml môi trường BHI lỏng đựng trong bình tam giác loại 100ml,
bồi dưỡng có lắc ở điều kiện 370C/24 giờ. Huyễn dịch độc tố thu được bằng
cách li tâm canh trùng 10.000 - 20.000 vòng/phút ở điều kiện lạnh, trong 10 phút. Bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần:
+ Một phần bảo quản ở 40C để thử độc tố không chịu nhiệt.
+ Phần còn lại đun cách thủy ở 800
C trong 10 phút sau đó bảo quản ở điều kiện 40
C, để thử độc tố chịu nhiệt. Chuẩn bị động vật thí nghiệm:
Chọn thỏ khỏe có khối lượng 2,5 - 3 kg, cắt trụi lông ở phần lưng, có thể xoa thêm kem rụng lông để làm sạch hết phần chân lông còn lại, dùng bút dạ chia mảng da này thành những ô vuông nhỏ có kích thước cạnh 2 x 2cm.
Chính giữa mỗi ô vuông, tiêm nội bì 0,1ml dịch độc tố đã được chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm ở 2 ô ở 2 vị trí xa nhau, đối chứng âm là môi trường BHI lỏng vô trùng. Sau khi tiêm 18 giờ với độc tố không chịu nhiệt và sau 2
giờ với độc tố chịu nhiệt, thỏ thí nghiệm được tiêm tĩnh mạch tai dung dịch Evan Blue, liều 40mg/kg thể trọng. Nuôi tiếp 2 giờ, giết thỏ, lột da đọc kết quả phản ứng.
Đọc kết quả phản ứng:
+ Phản ứng dương tính khi ở trên ô vuông thí nghiệm, vùng thẩm xuất
Evan Blue có diện tích ≥ 16mm2 (4 x 4mm).
+ Phản ứng âm tính khi ô vuông trên da thỏ thí nghiệm không có vùng thẩm xuất Evan Blue.
+ Phản ứng được coi là nghi ngờ khi trên ô vuông da thỏ thí nghiệm có
vùng thẩm xuất Evan Blue nhưng diện tích < 16mm2
.
2.4.5. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập trên chuột bạch
Thử độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được qua tiêm truyền trên chuột theo Quin. P. J et al (1994) [63]. Các bước thực hiện như sau:
- Bước 1: Các vi khuẩn từ môi trường giữ giống được cấy chuyển vào môi
trường BHI trong bình tam giác 100ml. Canh trùng được bồi dưỡng ở 370
C/24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc đảo để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
- Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng từ 18 - 20g/con), với liều tiêm là 0,2ml/chuột vào phúc mạc. Lô đối chứng gồm 2 chuột được tiêm dung dịch BHI với liều tiêm và đường tiêm tương tự.
- Bước 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết, số lượng chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Mổ khám, phân lập vi khuẩn từ máu tim của chuột bị chết.
2.4.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được phân lập được
Thử tính mẫn cảm của vi khuẩn E. coli phân lập được kiểm tra bằng
phương pháp khu ếch tán trên thạch và đánh giá kết quả theo Bauer . A. W
(1966) [38], Quinn. P. J et al (1994) [63].
Lấy 3 ống nghiệm sạch, hút nước cất cho vào ống nghiệm mỗi ống 0,9ml. Hút canh khuẩn 0,1ml của môi trường BHI đã cấy trong tủ ấm 370
C trong 24 giờ. Cho vào ống thứ nhất trộn đều, hút 0,1ml sang ống thứ 2 trộn đều, hút tiếp 0,1ml sang ống thứ 3 (sử dụng làm kháng sinh đồ ở nồng độ 10-3).
Hút 0,5ml từ dung dịch đã pha loãng ở nồng độ 10-3, nhỏ vào mặt thạch, sau đó dùng 1 ống nghiệm sạch láng đều mặt thạch .
Dùng panh vô khuẩn kẹp giấy tẩm kháng sinh chế sẵn , đặt nhẹ nhàng lên bề mặt đĩa thạch , các khoanh giấy kháng sinh đặt cách nhau 2cm và không quá 6 khoanh giấy trên một đĩa thạch . Để úp đĩa thạch xuống , bồi dưỡng trong tủ ấm 370
C trong 24 giờ.
Kết quả thu được đánh giá theo 4 mức độ mẫn cảm, căn cứ vào đường kính vòng vô khuẩn (φ):
+ Rất mẫn cảm: φ > 20mm
+ Mẫn cảm trung bình: φ > 15 - 20mm + Mẫn cảm yếu: φ > 10 - 14mm
+ Kháng thuốc: φ < 10mm
2.4.7. Chế tạo auto - vaccine
Chế tạo auto - vaccine theo Markku Johansen et al (1997) [58].
2.4.7.1. Bồi dưỡng kháng nguyên E. coli phục vụ chế auto - vaccine
Chọn các chủng E. coli điển hình, tiến hành bồi dưỡng kháng nguyên bám dính trong môi trường thích hợp để ổn định yếu tố bám dính:
+ Môi trường thạch Minca: bồi dưỡng kháng nguyên bám dính F5. + Môi trường thạch Bromthymol blue: bồi dưỡng kháng nguyên bám dính F6.
+ Môi trường thạch Isosensites + Alizaringell + Eosin: bồi dưỡng kháng nguyên bám dính F107.
Sau đó, các chủng E. coli tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường Brain Heart Infusion broth (BHI) để bồi dưỡng sản sinh độc tố gây bệnh.