2.1.1. Nguyên liệu chính
Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là trái táo tây hay còn gọi là Pom. Có danh pháp khoa học là Malus domestica. Loài cây thân gỗ này thuộc họ hoa hồng. Đây là một trong những loài cây ăn trái phổ biến nhất.
Tên tiếng Anh là Apple Tên tiêng Pháp là Pomme
Một loài Pom rừng tìm thấy ở nước ta đó là loài Malus doumeri Chev Gan, mọc ở rừng kontum và Đà Lạt trên độ cao 1000 – 2000m.
Hình 2.1. Nguyên liệu táo
Táo được mua ở chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa.
2.1.2. Nguyên liệu phụ 2.1.2.1. Đường
Đường được sử dụng với mục đích làm tăng hàm lượng đường trong dịch quả dùng để lên men. Đường được sử dụng là đường trắng và thỏa mãn các yêu cầu sau:
Hàm lượng Saccharose > 99% Lượng nước < 0,2 %
Đường phải trắng, tinh thể, không có tạp chất, lượng đường khử < 0,1 % Hàm lượng tro < 0,03%
2.1.2.2. Acid citric
Acid citric được dùng để làm tăng độ chua của dịch quả lên men, giảm pH của dịch để đảm bảo điều kiện tốt cho nấm men hoạt động. Acid citric được dùng phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
Hàm lượng acid citric > 99% Lượng nước < 0,2%
Dạng tinh thể không lẫn tạp chất.
2.1.2.3. Nước
Được dùng để rửa nguyên liệu và dụng cụ, thiết bị trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Nước sử dụng phải đạt tiêu chuẩn nước sạch, sử dụng trong sản xuất và sinh hoạt, được cấp từ công ty nước tỉnh Khánh Hòa. Nước sử dụng để sản xuất rượu vang phải đảm yêu cầu của nước dùng trong ăn uống theo TCVN 6213:2004.
2.1.2.4. Enzyme pectinase
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần khác nhau. Nhiệt độ hoạt động tối thích của các enzyme này trong khoảng 45 – 520C
Trong công nghiệp, pectinase được ứng dụng để phân giải pectin nhằm nâng cao hiệu suất ép, lọc nước quả, làm trong rượu vang và nước quả.
2.1.2.5. Nấm men
Nấm men sử dụng là loại Saccharomyces cerevisae thuần chủng, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại Học Nha Trang
Hình 2.2. Nấm men dùng làm thí nghiệm 2.1.2.6. Vitamine C
Vitamine C được sử dụng nhằm chống quá trình oxy hóa làm biến màu của dịch quả trong quá trình ép. Vitamine C sử dụng phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
Hàm lượng vitamine C > 99% Hàm lượng Al: 0,0003% Hàm lượng Fe: 0,0005%
Hàm lượng kim loại nặng (như Pb): 0,001% Khối lượng riêng: 176,14
2.1.3. Vi sinh vật dùng trong chế biến vang táo
Để chế biến rượu vang người ta sử dụng nhiều chủng nấm men thuần khiết như:
Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces uvarum hoặc Saccharomyces oviformis.
Để nghiên cứu chế biến vang táo tôi sử dụng chủng nấm men Saccharomyces cerevisae
được giữ trong ống nghiệm, men ở dạng tiềm sinh, trong môi trường thạch. Chủng nấm men này có nguồn gốc tại Việt Nam, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh vật trường Đại Học Nha Trang. Do Saccharomyces cerevisae có nhiều ưu điểm là: lên men nhanh và sâu các loại đường, kết lắng tốt do đó dễ tách sinh khối nấm men ra khỏi dịch lên men, tạo mùi thơm đặc trưng cho rượu vang, bền vững với rượu, acid và các chất sát trùng.
2.1.4. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
Máy ép trái cây Cân điện tử Máy đo pH Nồi hấp tiệt trùng
Thiết bị chưng cất đơn giản Tủ cấy
Máy lắc
Các dụng cụ khác ở phòng thí nghiệm…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp phân tích kiểm nghiệm
Các phương pháp này được tham khảo trong cuốn “ Phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men” – PGS. TS Lê Thanh Mai (chủ biên), trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội 2007 do nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật ban hành.
2.2.1.1. Phân tích hóa học
a. Xác định thành phần hóa học của táo
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy - Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung b. Xác định độ rượu của dịch lên men
Độ rượu là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mẫu lên men mạnh hay yếu và phần nào đánh giá được chất lượng của rượu.
Xác định nồng độ rượu dựa theo phương pháp cân đo tỷ trọng rồi tra bảng để tìm % thể tích hoặc % khối lượng.
c. Xác định đường khử bằng phương pháp Graxianop
Nguyên tắc:
Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với ferrixyanua sẽ khử ferrixyanua thành ferroxyanua và đường khử chuyển thành acid đường. Dùng metylen xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc. Phản ứng chính như sau:
2K2Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 2K4Fe(CN)6 + 2H2O + COOH(CHOH)4COOH
2.2.1.2. Kiểm nghiệm cảm quan mẫu rượu vang
Dựa trên các tài liệu kiểm nghiệm, cách đánh giá tiêu chuẩn chất lượng rượu vang và TCVN 3215 – 79 tiêu chuẩn phân tích cảm quan sản phẩm thực phẩm
2.3. Chọn quy trình dự kiến
Nguyên liệu táo Rửa
Xử lý cơ học Bổ sung enzyme pectinase, vitamine C
Ủ ở 400C t= 1÷1.5h
Ép
Điều chỉnh thành phần đường, acid citric, sunfate amone
Lên men Nhân giống Nấm men
Xử lý sau lên men
Đóng chai
Rượu vang táo
Từ quy trình này tôi sẽ nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men như: tỷ lệ vitamine C và enzyme pectinase bổ sung, hàm lượng đường của dịch quả đem lên men, tỷ lệ nước cái men so với dịch quả đem lên men và thời gian lên men thích hợp.
2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.4.1. Nhân giống cấp nhỏ để phục vụ lên men
Dụng cụ nhân giống phải được rửa sạch và bao gói sấy vô trùng ở 1600C trong 2h.
Môi trường để nhân giống cấp một: là dịch nước quả có nồng độ đường là 120g/l ở nhiệt độ 20 – 250C
Dùng que cấy nấm men vào ống nghiệm chứa 10ml dịch nước quả đã được thanh trùng ở P = 1,2 at, t0 = 1210C trong 15 phút. Nấm men trong ống nghiệm này tiếp tục được nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 20 – 250C. Và để ống nghiệm trên máy lắc để hòa tan oxy vào dịch quả.
Môi trường để nhân giống cấp hai: là dịch nước quả có nồng độ đường là 120g/l ở nhiệt độ 20 – 250C như môi trường nhân giống cấp 1.
Chuyển dịch nước quả chứa nấm men trong ống nghiệm sang bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml dịch nước quả và tiếp tục nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 20 – 250C như quá trình nhân giống cấp 1.
Sau khi nhân giống ta tiến hành đếm số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm. Khi số lượng nấm men đạt khoảng 100 triệu tế bào/ml dịch nấm men ta có thể bổ sung vào dịch nước quả lên men.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm:
2.4.2.1. Thí nghiệm xác định tỷ lệ acid ascorbic cần bổ sung
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tỷ lệ acid ascorbic cần bổ sung
0% vitamin C Thịt quả Bổ sung 0,1% pectinaza vào thịt quả Ủ ở 400C, t= 1 ÷ 1,5h Ép dịch 0,05% vitamin C 0,1% vitamin C 0,15% vitamin C 0,2% vitamin C
Đánh giá màu sắc dịch quả sau khi ép
Xác định lượng vitamine C cần bổ sung
Acid ascorbic là một chất hoạt động sinh học mạnh nên được dùng làm chất bảo quản chống biến màu sản phẩm. Ngoài ra, việc bổ sung acid ascorbic còn làm tăng thêm giá trị dinh dưỡng, góp phần tạo nên vị hài hòa cho sản phẩm, làm giảm giá trị pH của dịch thu được.
Aicd ascorbic không bền vững và dễ bị nhiều yếu tố lý hóa làm hỏng. Khi ngâm rửa các loại rau quả đã gọt vỏ, cắt thái, chất này rất dễ bị nước kéo đi. Khi đun nóng nó dễ bị phân hủy. Đặc biệt, acid ascorbic dễ bị oxy hóa bởi enzyme ascorbatoxydase. Ánh sáng cũng tham dự vào việc xúc tiến oxy hóa acid ascorbic. Trong môi trường acid, vitamine C khá bền vững và nó có thể chịu được nhiệt độ lên tới 1000C song nếu là môi trường kiềm thì nó bị oxy hóa nhanh chóng.
Để làm thí nghiệm ta tiến hành như sau:
Nguyên liệu được gọt vỏ, bỏ hạt để tạp chất không lẫn vào nước quả sau này. Nghiền sơ bộ để phá vỡ phần xenlulose quanh tế bào, ép được dễ hơn. Cho vào 5 hủ thủy tinh mỗi hủ 200g thịt quả đã được nghiền nhỏ, bổ sung vitamine C với hàm lượng 0,05%; 0,1%; 0,15%; 0,2% và mẫu không bổ sung vitamine C để đối chứng, tiếp đó ta bổ sung 0,1% enzyme pectinase vào thịt quả. Sau đó ủ ở nhiệt độ 400C trong 1 – 1,5h.
2.4.2.2. Thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme pectinaza cần bổ sung.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tỷ lệ enzyme pectinase cần bổ sung
Mẫu 1 0% pectinaza Thịt quả + vitamine C Mẫu 2 0,1% pectinaza Mẫu 4 0,2% pectinaza Mẫu 3 0,15% pectinaza Mẫu 5 0,25% pectinaza Ủ ở 400C, t = 1 ÷ 1,5h
Xác định -Số ml dịch mỗi mẫu -Cảm quan mỗi mẫu
Lượng pectinaza cần bổ sung Ép dịch
Ép là quá trình thu dịch từ quả sau khi nghiền nát hay giã nhỏ nhằm thu được lượng dịch lớn nhất đem đi lên men. Đối với lên men rượu vang trắng thì quá trình ép được tiến hành ngay sau khi nghiền hay giã. Mặc dù vậy trong quá trình ép rất dễ xảy ra quá trình oxy hóa làm giảm chất lượng sản phẩm nên phải có biện pháp chống oxy hóa.
Sự tách dịch quả phụ thuộc vào độ thẫm thấu của tế bào mô quả, độ nhớt, độ chắc của thịt quả và phụ thuộc vào thành phần số lượng và chất lượng pectin có trong quả. Trong đó, pectin có trong thành phần dịch tế bào, màng tế bào và màng trung gian, nó giống như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Là một chất sinh trùng hợp, pectin nâng cao khả năng giữ nước của mô quả, có khả năng tạo gel và do đó ngăn cản quá trình thoát dịch ra ngoài.
Để nâng cao hiệu suất thu hồi dịch quả cần phá vỡ cấu trúc cơ – lý của quả, phá hủy hệ keo nhằm tạo điều kiện cho dịch quả thoát ra ngoài một cách dễ dàng. Sử dụng chế phẩm enzyme chính là một phương pháp tối ưu, không những đảm bảo phân hủy cả mô cơ bản và mô che chở để thu được lượng dịch tối đa cùng các chất màu và chất thơm mà còn có tác dụng làm trong dịch quả.
Để làm thí nghiệm ta tiến hành như sau:
Nguyên liệu được gọt vỏ, bỏ hạt để tạp chất không lẫn vào nước quả sau này. Nghiền sơ bộ để phá vỡ phần xenlulose quanh tế bào, ép được dễ hơn. Cho vào 5 hủ thủy tinh mỗi hủ 200g thịt quả đã được nghiền nhỏ, bổ sung vitamine C để chống quá trình oxy hóa làm biến màu nước quả. Sau đó bổ sung vào mỗi hủ với hàm lượng enzyme như sau: 0,1%; 0,15%; 0,2%; 0,25% và mẫu 0% để đối chứng. Rồi ủ ở nhiệt độ 400C trong 1 – 1,5h.
2.4.2.3. Thí nghiệm xác định nồng độ đường cần bổ sung cho lên men.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nồng độ đường bổ sung thích hợp
Dịch quả
Bổ sung 20% nước
Nghiên cứu xác định lượng đường
160g/l 180g/l 200g/l 220g/l 240g/l
Lên men
Xác định
Lượng đường cần bổ sung
- pH = 3,5 - Sunfate amone 0,5g/mẫu
- 400ml dịch/mẫu
T = 192h
Tỷ lệ nước cái men so với dịch lên men là 10%
- Cảm quan mỗi mẫu - Độ rượu
Trong môi trường lên men, đầu tiên nấm men hấp thụ đường lên bề mặt tế bào của nó sau đó khuyếch tán qua màng bán thấm của tế bào vào trong tế bào. Sự khuyếch tán này tuân theo quy luật chung của sự thẩm thấu. Trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men, đường được chuyển hóa thành ethanol và CO2. Sự lên men chuyển đường thành etylic là một dãy quá trình oxy hóa khử có enzyme trong tế bào nấm men tham gia. Rượu etylic và CO2 tạo thành liền thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tán vào trong môi trường.
Vậy tỷ lệ đường là thông số ảnh hưởng lớn đến mùi vị và ảnh hưởng trực tiếp đến độ cồn của rượu. Do đó cần xác định tỷ lệ đường bổ sung thích hợp cho dịch lên men là cần thiết để tạo ra sản phẩm có hương vị tốt nhất.
Để làm thí nghiệm ta tiến hành như sau:
Xác định hàm lượng đường có sẵn trong dịch quả táo sau khi ép bằng khúc xạ kế. Thông thường hàm lượng đường này dao động trong khoảng 110 – 140 g/l dịch quả. Sau đó cho vào 5 mẫu thí nghiệm một hàm lượng đường thích hợp để sau khi bổ sung, các mẫu lần lượt có hàm lượng đường là 160 g/l, 180 g/l, 200 g/l, 220 g/l, 240 g/l mỗi mẫu có thể tích là 400ml dịch quả.
Sau khi điều chỉnh hàm lượng đường trong dịch quả ta tiến hành điều chỉnh pH của dịch quả. Thông thường pH của dịch táo là 4 – 4,5 ta cho thêm 1 lượng nhỏ acid citric vào dịch quả để pH là 3,5. Tiếp theo bổ sung amone sunfat. Rồi tiến hành lên men ở nhiệt độ thường với các điều kiện giống nhau:
2.4.2.4. Thí nghiệm xác định tỷ lệ nước cái men thích hợp
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tỷ lệ nước cái men bổ sung thích hợp
- Hàm lượng đường TN3 - pH = 3,5
- Sunfate amone 0,5g/mẫu - 400ml dịch/mẫu
Dịch quả
Bổ sung 20% nước
Điều chỉnh thành phần
Nghiên cứu xác định tỷ lệ nước cái men bổ sung
6% 8% 10% 12% 14%
Lên men
Tỷ lệ nấm men thích hợp Xác định
- Cảm quan mỗi mẫu - Độ rượu
Sau khi đã xác định hàm lượng đường và pH thích hợp ta tiến hành xác định lượng nấm men thích hợp.
Khi tỷ lệ dịch bổ sung vào hỗn hợp lên men càng tăng thì độ cồn đạt được càng cao vì khi đó số lượng tế bào nấm men trong dịch lên men càng nhiều nên lượng đường chuyển hóa càng triệt để hơn, do đó độ cồn đạt được cao hơn. Tuy nhiên nếu số lượng nấm men trong dịch quả quá cao thì thời gian lên men chính ngắn, tốt trong sản xuất nhưng nếu thời gian quá ngắn thì mùi vị của rượu không đạt.
Khi tỷ lệ dịch men bổ sung vào hỗn hợp lên men ít không đủ cho quá trình lên men làm cho vi khuẩn lạ có điều kiện hoạt động tạo ra các sản phẩm phụ làm giảm chất lượng của rượu như hoạt động của vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic… làm rượu bị chua
Men giống là yếu tố quyết định hàng đầu cho quá trình lên men nhanh hoặc chậm, mạnh hay yếu. Lượng men bổ sung vào dịch lên men phải đảm bảo đủ cho quá trình lên men diễn ra nhanh, mạnh mà không tạo điều kiện cho các vi khuẩn lạ khác phát triển. Tỷ lệ dịch men bổ sung ảnh hưởng lớn đến thời gian lên men chính, độ cồn đạt được hay ảnh hưởng đến chất lượng rượu thành phẩm.
Để tiến hành thí nghiệm này cũng phải thực hiện các bước như thí nghiệm trên. Trước đó phải chuẩn bị gây giống nấm men cấp nhỏ để đạt tỷ lệ nước cái men so với dịch quả là: 6%, 8%, 10%, 12%, 14%.
Mỗi mẫu thí nghiệm có thể tích là 400 ml.
Sau khi điều chỉnh hàm lượng đường trong dịch quả, tiến hành điều chỉnh pH của môi trường, bổ sung amone sunfat. Tiến hành bổ sung nấm men với tỷ lệ là: 6%, 8%, 10%, 12%, 14%.
2.4.2.5. Thí nghiệm xác định thời điểm kết thúc lên men.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thời gian lên men thích hợp
Dịch quả
Điều chỉnh thành phần Bổ sung 20% nước
- Lượng đường TN3 - pH = 3,5
- Sunfate amone 0,5g/mẫu - 400ml dịch/mẫu
T = 120h T = 168h T = 216h T =264 h T = 312h
Xác định
Thời gian lên men thích hợp
- Cảm quan mỗi mẫu