Do thời gian nghiên cứu có hạn, nên chúng tôi thử nghiệm làm khô sinh khối nấm men theo quy trình sản xuất sinh khối vi sinh của viện Vaccine Nha Trang: làm khô sinh khối nấm men S.carlsbergensis. Kết quả sấy khô sinh khối nấm men được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của men sau sấy
Màu sắc Màu vàng sáng Màu vàng đậm Mùi Mùi đặc trưng của nấm men S.carlsbergensis, không có mùi lạ CFU/1g men khô 7.2 x 108 CFU/g Nấm men chết
Nhận xét:
Từ bảng 3.1 ta thấy khi sấy sinh khối nấm men S.carlsbergensis ở nhiệt độ 400C thì màu sắc của sinh khối sau khi sấy có màu vàng sáng và tế bào nấm men vẫn còn sống. Còn khi sấy ở nhiệt độ 700C thì màu sắc của sinh khối sau khi sấy có màu vàng đậm và tế bào nấm men không còn sống. Mùi của sinh khối nấm men đều mang mùi thơm đặc trưng của nấm men không có mùi vị lạ.
3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH NUÔI THU SINH KHỐI S.CARLSBERGENSIS
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình nuôi S.carlsbergensis thu sinh khối nấm men dùng cho chăn nuôi như sau:
Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị môi trường nước chiết giá: lấy 20% giá đỗ xanh (so với 1lít môi trường dạng dịch cần pha) cho nước ngập giá và đun sôi khoảng 20 phút, sau đó chiết lấy phần nước lọc (chú ý: để tận thu hết chất dinh dưỡng trong giá ta nên cho bã sau khi lọc vào máy dập mẫu để vắt bã cho triệt để). Tiếp đó ta bổ sung các chất
Ly tâm dịch sau nuôi Môi trường nước chiết giá
Nhân giống cấp I Hoạt hóa S.carlsbergensis Nhân giống cấp II Nhân giống cấp III - Dịch tự thủy phân nấm men: 0.5% - Saccharose: 5% - MgSO4: 0.25% - K2HPO4: 0.15% - Giá đỗ xanh: 20% - Nước: 1000 ml - pH = 5 Khử trùng ở 1210C, trong 20phút T0 = 280C Thời gian: 40 giờ Tốc độ lắc: 220 v/p T0 = 280C Thời gian: 40 giờ Tốc độ lắc: 220 v/p T0 = 280C Thời gian: 40 giờ Tốc độ lắc: 220 v/p Sinh khối Ủ Sấy Đường lactose: 15%
Men khô Men khô
400C, 48h 700C, 48h
Thời gian: 24h Nhiệt độ: 280C
dinh dưỡng là: dịch tự thủy phân nấm men 0.5%, đường saccharose 5%, MgSO4 0.25%, K2HPO4 0.15%. Đun sôi khoảng 3 phút để các thành phần trong môi trường hòa tan hết, và điều chỉnh pH môi trường nuôi là 5 bằng NaOH 0.1N & HCl 0.1N. Rồi phân vào các bình tam giác đã làm nút bông không thấm nước được sấy khô ở 1600C trong 2 giờ. Sau đó đem môi trường đi khử trùng ở 1atm, 1210C, trong 20 phút. Môi trường pha để dùng dần, trước khi dùng phải kiểm tra lại môi trường đảm bảo môi trường nuôi cấy không bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ bằng cách để vào tủ ấm khoảng 24 ÷ 48 giờ, rồi lấy ra kiểm tra.
Hoạt hóa S.carlsbergensis: S.carlsbergensis dùng cho nghiên cứu được bảo quản lạnh trên môi trường Hansen thạch nghiêng. Khi sử dụng được hoạt hóa bằng cách đem cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng, đặt trong tủấm 250C sau 24 ÷ 48 giờ.
Nhân giống cấp I: cấy S.carlsbergensis từ ống giống vào bình tam giác 100ml chứa 10ml dịch môi trường nước chiết giá đỗ xanh, rồi để vào máy lắc, lắc ở tốc độ lắc 220 vòng/phút và thời gian 40 giờ, nhiệt độ 280C.
Nhân giống cấp II: các chủng giống cấp I đã phát triển tốt được chuyển sang môi trường nước chiết giá đỗ xanh dạng dịch đựng trong bình tam giác 250ml với tỷ lệ 10% giống, điều kiện nhân giống như nhân giống cấp I.
Nhân giống cấp III: được nhân từ giống cấp II với tỷ lệ giống 10%, điều kiện nhân giống như nhân giống cấp I. Giống cấp III được dùng để nuôi thu sinh khối.
Ly tâm dịch sau nuôi cấy: sau khi nhân giống cấp III tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút ở 20 phút, sau đó loại bỏ phần nước trong và thu hồi sinh khối.
Sinh khối: sinh khối thu được sau khi ly tâm bổ sung đường lactose 15%, và trộn đều.
Mục đích của việc bổ sung đường lactose là nhằm làm khô nấm men hạn chế việc tạo huyền phù dẫn đến khó làm khô nấm men.
Ủ: thời gian khoảng 24h, nhiệt độ 280C. Ở giai đoạn ủ do bổ sung đường lactose dẫn đến áp suất thẩm thấu ở bên ngòai tế bào nấm men cao hơn bên trong
gây hiện tượng nước thẩm thấu ra khỏi tế bào nấm men giúp làm khô tế bào một cách dễ dàng.
Sấy: tiến hành sấy chân không thu sinh khối khô ở áp suất 0.8at theo 2 chế độ nhiệt độ khác nhau:
− Sấy ở nhiệt độ 400C, thời gian 48 giờ. Sấy ở nhiệt độ 400C để tế bào nấm men S.carlsbergensis còn sống. Do vậy sinh khối này có thể sử dụng làm nguồn men giống cho quá trình chăn nuôi.
− Sấy ở nhiệt độ 700C, thời gian khoảng 48 giờ. Sấy ở nhiệt độ này để các tế bào nấm men chết hoàn toàn. Do vậy sinh khối này có thể sử dụng làm nguồn cung cấp dinh dưỡng cho quá trình nuôi vật nuôi.
* Sản xuất thử và sơ bộ đánh giá sinh khối S.carlsbergensis khi nuôi cấy trên môi trường nước chiết giá so với môi trường cơ bản (môi trường Hansen)
Tiến hành nuôi cấy S.carlsbergensis trên môi trường nước chiết giá theo quy trinh trên và nuôi trên môi trường cơ bản (môi trường Hansen) sau đó lấy mẫu quan sát hình ảnh tế bào trên kính hiển vi 3 mắt, độ phóng đại 1000 lần, phân tích hàm lượng protein và đánh giá lượng sinh khối thu được, kết quả thể hiện:
Hình 3.12. Hình ảnh S.carlsbergensis
nuôi trên môi trường Hansen
Hình 3.13. Hình ảnh S.carlsbergensis
nuôi trên môi trường tự nhiên Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng protein của S.carlsbergensis
Hàm lượng protein của S.carlsbergensis (µg/ml)
Nuôi cấy bằng môi trường cơ bản (MT Hansen)
Nuôi bằng môi trường nước chiết giá đỗ xanh
3.0912 3.0876
Bảng 3.3. Khối lượng sinh khối thu hồi của S.carlsbergensis (g/l) Khối lượng sinh khối của S.carlsbergensis (g/l)
Nuôi cấy bằng môi trường cơ bản (MT Hansen)
Nuôi bằng môi trường nước chiết giá đỗ xanh
50.63 50.79
Nhận xét:
Từ hình 3.13 và hình 3.14 ta thấy về hình thái của S.carlsbergensis khi nuôi bằng môi trường Hansen và môi trường tự nhiên cũng có khác biệt chút ít nhưng không đáng kể. Qua quan sát cho thấy dường như khi nuôi bằng môi trường Hansen thành tế bào dày hơn. Tuy thế đối với mục đích chăn nuôi thì thành tế bào dày lại làm hạn chế khả năng tiêu hóa của vật nuôi. Tương tự như vậy khi xác định hàm lượng protein và lượng sinh khối nấm men khi nuôi trên các môi trường nuôi này cũng có kết quả tương tự (theo bảng 3.2 và 3.3). Như vậy có thể sử dụng môi trường tự nhiên để sản xuất sinh khối nấm men S.carlsbergensisđể dùng cho chăn nuôi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua các kết quả nghiên cứu thu được trên có thể rút ra một số kết luận sau: 1. Đã xác định được các điều kiện thích hợp cho hoạt hóa S.carlsbergensis
bằng môi trường Hansen là: thời gian 32 giờ, pH 5, nhiệt độ 280C.
2. Đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sinh khối
S.carlsbergensis trên môi trường tự nhiên là: tỷ lệ giá để thu nhận nước chiết giá là 20%; các chất dinh dưỡng bổ sung là: saccharose 5%, dịch tự thủy phân nấm men 0.5%, MgSO4 0.25% và K2HPO4 0.15%; Thời gian nuôi 36÷ 40giờ, pH môi trường nuôi 5.
3. Đã thu nhận nấm men nuôi bằng môi trường tự nhiên và nhận thấy có thể làm khô nấm men bằng cách bổ sung 15% lactose và sấy ở 400C trong điều kiện chân không để thu sinh khối sống của nấm men và sấy ở 700C trong điều kiện chân không để thu sinh khối chết của nấm men.
KIẾN NGHỊ
Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất ý kiến là cần sản xuất sinh khối
S.carlsbergensis theo quy trình đề xuất và sử dụng sinh khối thu được trong chăn nuôi gia súc hay nuôi trồng thủy hải sản để từđó đánh giá đúng đắn về khả năng sử dụng sinh khối nấm men nuôi trên môi trường tự nhiên làm nguồn cung cấp protein cho chăn nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng (chủ biên), Nguyễn Đình Quyên, Phạm Văn Ty (2000),
Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
2. Nguyễn Lân Dũng (1992), Tìm hiểu về Công nghệ Sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng (dịch từ bản tiếng Nga) (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp – Hà Nội.
4. Nguyễn Thành Đạt (1990), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội.
5. Bùi Đức Hợi (chủ biên), Hoàng Thị Ngọc Châu, Lê Thị Cúc, Lê Hồng Khanhh, Mai Văn Lễ, Lê Ngọc Tú, Chế biến lương thực, Tập 1, trường Đại học Bách Khoa – Hà Nội.
6. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Tập 1, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh.
7. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Lương Đức Phẩm (2005), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
9. Nguyễn Công Tạn (2006), Giá trị dinh dưỡng của đậu tương, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Tươi (2005), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học Probiotic dùng cho nuôi tôm kinh tế và cải thiện môi trường nước nuôi tôm, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Bách Khoa – Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
11. Caroline H. Damsky (1976), Environmentally induced changes in mitochondria and endoplasmic reticulum of Saccharomyces carlsbergensis yeast,
Pennsylvania 19174. Dr. Damsky's present address is The Wistar Institute, Philadelphia, Pennsylvania 19104.
12. Lynne McLandsborough - Food micro biology laboratory – CRC Series in Contempoary Food Science – University of Massachusetts, Amherst
Một số trang web: 13.http://www.khuyennongvn.gov.vn/k-ban-co-biet/bap-cai-va-nhung-tac- dung-tuyet-voi 14. http://www.lamchame.com/fourm/showthread 15. http://old.netmode.com.vn/2006/09/612152/ 16. http://tintuc.timnhanh.com/doi_song/suc_khoe 17. http://vietsciences.org 18. http://vi.wikipedia.org/wiki
Phụ lục 01:
Bảng 3.3. Sự biến đổi mật độ quang theo thời gian hoạt hóa cho
S.carlsbergensis
Thời gian (giờ) OD620nm
0 0.489 24 0.995 28 1.219 32 1.358 36 1.338 40 1.308 44 1.297
Bảng 3.4. Sự biến đổi mật độ quang theo pH cho hoạt động của
S.carlsbergensis pH OD620nm 4 1.382 4,5 1.4 5 1.478 5,5 1.466 6 1.422 6,5 1.366
S.carlsbergensis Nhiệt độ (t0C) OD620nm 20 1.315 24 1.645 28 1.840 32 1.751 36 1.736
Bảng 3.6. Sự biến đổi mật độ quang theo môi trường nuôi tăng sinh khối
S.carlsbergensis MT OD620nm MT1 0.06 MT2 0.08 MT3 0.267 MT4 0.286 MT5 0.101 MT6 0.298
(MT1: Môi trường bột ngô, MT2: Môi trường cám, MT3: Môi trường nước chiết bắp cải, MT4: Môi trường nước chiết khoai tây, MT5: Môi trường đậu tương, MT6: Môi trường nước chiết giá).
khối S.carlsbergensis
Tỷ lệ cơ chất pha môi trường (%) OD620nm
5 0.474 10 0.675 15 0.757 20 0.793 25 0.695 30 0.486
Bảng 3.8. Sự biến đổi mật độ quang theo tỷ lệ đường saccharose cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis
Tỷ lệ đường saccharose (%) OD620nm
1 0.793 2 0.799 3 0.802 4 0.813 5 0.822 6 0.812 7 0.789 8 0.765
cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis Tỷ lệ dịch tự thủy phân nấm men (%) OD620nm 0.1 0.902 0.2 1.09 0.3 1.275 0.4 1.298 0.5 1.341 0.6 1.316 0.7 1.093 0.8 0.986 0.9 0.84 1 0.751
Bảng 3.10. Sự biến đổi mật độ quang theo hàm lượng K2HPO4 bổ sung cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis
Hàm lượng K2HPO4 (%) OD620nm 0.05 1.351 0.1 1.351 0.15 1.878 0.2 1.846 0.25 1.777 0.3 1.74 0.35 1.709 0.4 1.688
nuôi tăng sinh S.carlsbergensis Hàm lượng MgSO4 (%) OD620nm 0.05 1.341 0.1 1.442 0.15 1.478 0.2 1.496 0.25 1.568 0.3 1.536 0.35 1.523 0.4 1.492
Bảng 3.12. Sự biến đổi mật độ quang theo thời gian nuôi tăng sinh
S.carlsbergensis
Thời gian (giờ) OD620nm
0 1.361 28 2.698 32 2.895 36 3.045 40 3.150 44 3.072 48 3.059 52 3.057
S.carlsbergensis pH OD620nm 4 1.902 4,5 1.636 5 1.956 5,5 1.943 6 1.907 6,5 1.889
Phụ lục 02: Cách chế dịch tự thủy phân nấm men
Men bia rửa sạch ở dạng men sữa, rồi hòa với nước theo tỷ lệ 1:1, giữ ở 500C trong 24h. Chiết lấy phần nước trong, bỏ phần cặn, trung hòa và đun sôi. Dịch men tự phân đem cô để dùng dần để bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng sinh với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ.
Phụ lục 03: Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry Nguyên tắc
Phương pháp này có độ nhạy cao hơn 10 lần so với phương pháp biuret. Các amino acid có vòng thơm Tyr và Trp có mặt trong protein sẽ phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau tạo thành phức chất màu xanh đen có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 650nm. Dựa vào đường chuẩn protein để định lượng hàm lượng protein.
Hóa chất sử dụng
- Dung dịch albumin chuẩn 0.1%.
- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N.
- Dung dịch B: CuSO4 0.5% trong natri kali tatrat 1%. - Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và B theo tỷ lệ 50/1.
Cách tiến hành
- Cho vào ống nghiệm một lượng dung dịch mẫu tính toán sao cho khối lượng protein có trong dung dịch khoảng từ 0.02 ÷0.32mg protein. Thêm vào
cất đủ 5ml. Sau đó đem so màu ở bước sóng 650nm.
- Ống đối chứng: thay dung dịch mẫu bằng nước cất và tiến hành tương tự nhưống thí nghiệm.
- Dựng đường chuẩn protein: từ dung dịch protein chuẩn lấy vào các ống nghiệm một lượng protein lần lượt như sau: 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 320, 360µg protein. Thứ tự thành phần và tỷ lệ các hóa chất tương tự như trên và so màu ở bước sóng 650nm để dựng đường chuẩn protein.
Tính kết quả
Lấy hiệu số đọc trên máy của ống nghiệm và ống đối chứng sau đó đối chiếu với đồ thị chuẩn đểđịnh lượng protein
Hình 3.15: Hình ảnh khuẩn lạc
S.carlsbergensis khi cấy ria
Hình 3.17: Hình ảnh S.carlsbergensis
trong ống nghiệm Hình 3.16.b: Hình ảnh khuẩn lạc
S.carlsbergensis khi cấy trang
Hình 3.16.a: Hình ảnh khuẩn lạc