MTTN
Môi trường tự nhiên được pha như mục 2.3.2.1 rồi tiến hành các thí nghiệm 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, để xác định các điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh khối
S.carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên nghiên cứu.
a. Thí nghiệm 4: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Trong lên men công nghiệp việc lựa chọn môi trường thích hợp để duy trì khả năng tăng sinh mong muốn là rất cần thiết.
S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3 trong 6 môi trường dịch thể ký hiệu là: MT1, MT2, MT3, MT3, MT4, MT5, MT6 (thành phần môi trường như mục 2.3.2.1 – môi trường tự nhiên). Dịch sau nuôi cấy đem xác định mật độ quang.
b. Thí nghiệm 5: xác định tỷ lệ cơ chất làm môi trường nuôi
Sau khi chọn được môi trường thích hợp thì tỷ lệ cơ chất làm môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Tỷ lệ cơ chất làm môi trường ít hay nhiều đều ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh. Do đó tiến hành nghiên cứu tỷ lệ cơ chất làm môi trường nuôi S.carlsbergensis.
Sau khi chọn được môi trường tự nhiên ở thí nghiệm 4, tiến hành nghiên cứu tỷ lệ cơ chất pha môi trường dịch nuôi cấy tăng sinh với các tỷ lệ là: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% trong 1000ml dịch môi trường, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi S.carlsbergensis thích hợp.
c. Thành phần môi trường
• Thí nghiệm 6: xác định tỷ lệ nguồn cacbon (đường saccharose) bổ
Mặc dù bản thân môi trường nuôi cấy đã cho số lượng tế bào nhất định nhưng để tận thu triệt để lượng sinh khối ta cần bổ sung thêm các nguồn chất dinh dưỡng cần thiết. Có thể nói nguồn cacbon là nguồn năng lượng hàng đầu đối với nấm men, do vậy ta cần nghiên cứu bổ sung thêm nguồn cacbon. Nấm men S.carlsbergensis
thuờng sử dụng nguồn cacbon là các loại đường: saccharose, glucose, maltose,...Nguồn cacbon sử dụng ở đây là đường saccharose. Nấm men
S.carlsbergensis là loài nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20%. Khi nuôi cấy tăng sinh thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%. MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose với các nồng độ lần lượt là: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ đường saccharose bổ sung thích hợp.
• Thí nghiệm 7: xác định tỷ lệ nguồn nitơ (là dịch thủy phân nấm men – theo phụ lục 02) bổ sung vào môi trường tự nhiên nuôi cấy
Nguồn nitơ cũng là nguồn năng lượng rất cần thiết đối với nấm men
S.carlsbergensis, để thu được lượng sinh khối cao và chất lượng tốt ta nên bổ sung thêm nguồn nitơ. Nguồn dinh dưỡng nitơ cần thiết cho các cấu tử của tế bào chứa nitơ như: amino acid, protein, peptid,...Để có thể thu được một lượng lớn sinh khối
S.carlsbergensis trong điều kiện hiếu khí cần phải có nguồn nitơ hữu cơ cũng như vô cơ. Nguồn dinh dưỡng nitơ bổ sung ở đây là dịch tự thủy phân nấm men (sản xuất theo phụ lục 02). Dịch tự thủy phân nấm men được bổ sung với các tỷ lệ: 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1% trong 1000ml dạng dịch MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose theo tỷ lệ nghiên cứu ở thí nghiệm 6, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy
nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ bổ sung nguồn nitơ bổ sung thích hợp.
• Nguồn khoáng:
Nguồn khoáng có ảnh hưởng nhiều nhất đến hoạt động của tế bào nấm men
S.carlsbergensis là kali, photpho, magiê. Trong MTTN thường có đủ các chất khoáng đối với nhu cầu của nấm men S.carlsbergensis. Nên có thể không cần phải bổ sung thêm chất khoáng. Tuy nhiên trong nghiên cứu cũng như trong nuôi cấy tăng sinh để tận thu lượng sinh khối nên bổ sung thêm nguồn phospho kali ở dạng muối phosphat và magiê ở dạng muối sulfat. Muối bổ sung ở đây là K2HPO4 làm nguồn P và K và muối MgSO4 làm nguồn magiê được tiến hành nghiên cứu bổ sung vào môi trường nuôi cấy như thí nghiệm 8 và thí nghiệm 9.
− Thí nghiệm 8: xác định tỷ lệ muối K2HPO4 bổ sung vào môi trường tự
nhiên nuôi cấy
Muối K2HPO4 được bổ sung với các tỷ lệ: 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4% trong 1000ml MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose và dịch tự thủy phân nấm men theo nghiên cứu ở thí nghiệm 6, 7, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ bổ sung muối K2HPO4 thích hợp.
− Thí nghiệm 9: xác định tỷ lệ muối MgSO4 bổ sung vào môi trường tự
nhiên nuôi cấy
Muối MgSO4 được bổ sung với các tỷ lệ: 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4% trong 1000ml dịch MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose và dịch tự thủy phân nấm men theo nghiên cứu ở thí nghiệm 6, 7, bổ sung K2HPO4 theo nghiên cứu ở thí nghiệm 8, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi
cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ muối MgSO4 bổ sung thích hợp.
• Các nhân tố vitamin:
Trong MTTN thường có đủ các nhân tố vitamin đối với nhu cầu của nấm men
S.carlsbergensis. Nên có thể không cần phải bổ sung thêm.
d. Điều kiện nuôi cấy thích hợp bằng MTTN
Do MT nuôi cấy thay đổi nên các điều kiện nuôi cấy S.carlsbergensis cũng thay đổi. Do vậy, ta phải nghiên cứu lại một số điều kiện nuôi cấy như: thời gian nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy.
• Thí nghiệm 10: xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Có thể nói thời gian là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Xác định được ở thời gian nào mà S.carlsbergensis phát triển tốt nhất là vấn đề mà chúng tôi quan tâm nghiên cứu, từđó thu hồi lượng sinh khối nhiều nhất.
Các thí nghiệm được thực hiện trên môi trường tự nhiên dịch thể bổ sung đầy đủ các chất dinh dưỡng như nghiên cứu ở các thí nghiệm 4, 5, 6, 7, 8, 9
S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, tại pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi như ở thí nghiệm 2, 3. Để xác định thời gian thích hợp cho sinh trưởng bằng cách xác định mật độ quang. Lấy mẫu xác định giá trị mật độ quang ở các thời điểm sau: 28h, 32h, 36h, 40h, 44h, 48h, 52h.
• Thí nghiệm 11: xác dịnh pH môi trường nuôi cấy thích hợp
Các thí nghiệm được thực hiện trên môi trường tự nhiên dịch thể bổ sung đầy đủ các chất dinh dưỡng như nghiên cứu ở các thí nghiệm 4, 5, 6, 7, 8, 9. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH lần lượt là: 4 – 4.5 – 5 – 5.5 – 6 – 6.5. Nấm men
S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, tại thời gian nuôi ở thí nghiệm 10, nhiệt độ nuôi ở thí nghiệm 2. Sau nuôi xác định pH thích hợp cho sinh trưởng bằng cách xác định giá trị mật độ quang của dịch nuôi.