2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Công thức pha các môi trường nghiên cứu như sau:
Môi trường Hansen: môi trường Hansen được sử dụng hoạt hóa nấm men có công thức chế tạo như sau: pepton: 10g, đường saccharose: 50g, K2HPO4: 2.5g; MgSO4: 2.5g, (agar: 15g), nước: 1000ml.
Môi trường tự nhiên nuôi cấy nấm men với hàm lượng xác định như sau:
+ MT1 - môi trường nước chiết bột ngô: bột ngô 20g và nước 1000ml + MT2 - môi trường nước chiết cám: cám 20g và nước 1000ml + MT3 - môi trường nước chiết bắp cải: bắp cải 20g và nước 1000ml + MT4 - môi trường nước chiết khoai tây: khoai tây 20g và nước 1000ml + MT5 - môi trường nước chiết đậu tương: bột đậu tương 20g và nước 1000ml
+ MT6 - môi trường nước chiết giá đậu xanh: giá đậu xanh 20g, nước 1000ml Cách pha môi trường từ các nguyên liệu tự nhiên để nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh S.carlsbergensis: các cơ chất như bột ngô, cám, bắp cải, khoai tây, bột đậu tương, giá đậu xanh được cân một lượng xác định như trên cho nước vào và đun sôi khoảng 15 đến 20 phút, sau đó lọc bỏ bã chỉ lấy phần nước chiết trong. Phần nước chiết sau đó được phân phối vào các bình tam giác đã sấy khô ở 1600C trong 2 giờ, rồi đem đi khử trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 20 phút.
Môi trường tự nhiên có bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết
Sau khi tiến hành thí nghiệm tìm được môi trường tự nhiên thích hợp, tiến hành pha môi trường có bổ sung thêm các chất dinh dưỡng nghiên cứu bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng sinh.
a. Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường:
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. Để so sánh đặc tính và tốc độ phát triển của chúng thì các giống phải được nuôi tăng sinh trong cùng điều kiện để có tính chất sinh lý giống nhau.
Đểđảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. Đảm bảo các điều kiện lý hóa cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật.
b. Sơđồ thực hiện: Cân Bình tam Nấu cách Khử trùng (1210C, 20 Nước Cơ chất pha môi Bảo quản và kiểm tra môi
Thuyết minh sơđồ:
− Cho môi trường vào bình tam giác và nấu cách thủy để các thành phần trong môi trường hòa tan trong nước.
− Dùng bông gòn bịt kín miệng bình tam giác.
− Tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 phút. − Lấy môi trường ra khỏi nồi tiệt trùng, để nguội.
− Phân phối môi trường từ bình tam giác và dụng cụ. Đối với đĩa peptri lượng môi trường phân phối vào có độ dày khoảng 2mm. Đối với ống nghiệm lượng môi trường cho vào bằng 1/3 chiều cao của ống. Đối với bình tam giác lượng môi trường cho vào không quá 1/3 thể tích bình.
− Quá trình phân phối môi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản sau:
+ Môi trường khi được phân phối phải ở trạng thái lỏng.
+ Các thao tác phân phối cần phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không bị dính lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi môi trường hóa rắn (đối với môi trường làm vi sinh có agar).
− Bảo quản và kiểm môi trường;
+ Đối với môi trường chưa sử dụng, cần được bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ thấp (khoảng 20 ÷ 250C), hạn chế tác dụng của ánh sáng và không để môi trường bị khô.
+ Trước khi sử dụng lại phải kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, ta thường đặt chúng vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 42 ÷ 48 giờ, sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các môi trường có vi sinh vật phát triển.
2.3.2.2. Phương pháp hoạt hóa S.carlsbergensis từ đông khô
Thuyết minh quy trình:
− Saccharomyces carlsbergensis đông khô được nhận từ Bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa – Hà Nội.
− Chuẩn bị môi trường Hansen dịch thể pha như phần môi trường nuôi cấy vi sinh cho vào bình tam giác 250ml khoảng 100ml dịch thể, rồi khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội.
− Cấy S.carlsbergensis đông khô: lấy 1 vòng que cấy S.carlsbergensis
đông khô cho vào môi trường dịch thể Hansen. Cấy S.carlsbergensis
Lên men trong MT Hansen (T0 phòng, t = 48h, tốc độ lắc: 220vòng/phút)
Pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,85% vô trùng
S. carlsbergensis đông khô
Chuẩn bị môi trường Hansen dịch thể
Cấy lên môi trường thạch
Kiểm tra khuẩn lạc
Tách và tinh sạch khuẩn lạc
− Lên men: sau khi cấy S.carlsbergensisđông khô vào môi trường dịch thể xong ta để lên máy lắc, lắc tốc độ 220 vòng/phút, tại nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 2 ngày.
− Pha loãng mẫu: hút 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dd NaCl 0,85%. Đem lắc mẫu trên máy lắc. Pha loãng mẫu ttheo các nồng độ từ 10-1 đến 10-7. Lấy 0,1ml mẫu ở các nồng độ10-4, 10-6 rồi nhỏ vào các đĩa thạch riêng biệt đã ghi tên mẫu và nồng độ.
Sơđồ pha loãng mẫu như sau:
– Cấy lên môi trường thạch: dùng que cấy trang gạt đều mẫu trên bề mặt thạch. Sau đó để hộp Petri vào tủấm 250C, nuôi khoảng 2 ÷ 3 ngày.
− Tách và tinh sạch khuẩn lạc: sau khi nuôi cấy xong ta lấy ra chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có kích thước lớn nhất, cấy ria theo các đường rích rắc vào hộp Peptri chứa môi trường Hansen thạch. Rồi để vào tủấm 250C, nuôi 2 ÷ 3 ngày.
Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào nấm men dưới kính hiển vi.
− Giữ giống trong ống nghiệm: sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng.
Lưu ý: mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng: + Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ sấy được khử trùng bằng cồn. + Không khí trong tủđược khử trùng bằng tia UV.
+ Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 1ml 10-7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 9ml 1ml 1ml 9ml 10-6 0.1ml 0.1ml 0.1ml
2.3.2.3. Thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa
S.carlsbergensis bằng môi trường Hansen
Môi trường Hansen được pha như mục 2.3.2.1 rồi tiến hành các thí nghiệm 1, 2, 3 để xác định các điều kiện thích hợp cho hoạt hóa S.carlsbergensis bằng môi trường Hansen.
• Thí nghiệm 1: xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Có thể nói thời gian là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Xác định được ở thời gian nào mà phát triển tốt nhất là vấn đề mà tôi quan tâm nghiên cứu, từđó thu hồi lượng sinh khối nhiều nhất.
S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, tại nhiệt độ phòng, pH của môi trường nuôi là 6. Để xác định thời gian thích hợp cho sinh trưởng bằng cách đo giá trị mật độ quang OD620nmở các thời điểm sau: 24h, 28h, 32h, 36h, 40h.
• Thí nghiệm 2: xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp
pH môi trường có ý nghĩa quyết định đến tốc độ sinh trưởng, phát triển của hầu hết các vi sinh vật nói chung và S.carlsbergensis đang nuôi cấy nói riêng. Sự ảnh hưởng đó trực tiếp tác động tới khả năng sinh trưởng của chủng. Chính vì vậy việc tiến hành thí nghiệm tìm ra một pH môi trường nuôi thích hợp cho sự sinh trưởng là cần thiết, đồng thời duy trì giá trị pH đó trong suốt thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng.
Ở nhóm nấm men, với các giống men rượu và men bia Saccharomyces pH ban đầu thích hợp cho tăng sinh là khoảng 4.2 ÷ 6.2. Nấm men S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, tại nhiệt độ phòng trong thời gian nuôi cấy nghiên cứu ở thí nghiệm 1, môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH là: 4 – 4.5 – 5 – 5.5 – 6 – 6.5. Xác định pH môi trường nuôi thích hợp cho sinh trưởng bằng cách xác định giá trị mật độ quang.
• Thí nghiệm 3: xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, ở các nhiệt độ 200C, 240C, 280C, 320C, 360C với thời gian và pH môi trường nuôi xác định ở các thí nghiệm 1,
2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng bằng cách xác định giá trị mật độ quang.
2.3.2.4. Thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối bằng MTTN MTTN
Môi trường tự nhiên được pha như mục 2.3.2.1 rồi tiến hành các thí nghiệm 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, để xác định các điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh khối
S.carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên nghiên cứu.
a. Thí nghiệm 4: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Trong lên men công nghiệp việc lựa chọn môi trường thích hợp để duy trì khả năng tăng sinh mong muốn là rất cần thiết.
S.carlsbergensis được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3 trong 6 môi trường dịch thể ký hiệu là: MT1, MT2, MT3, MT3, MT4, MT5, MT6 (thành phần môi trường như mục 2.3.2.1 – môi trường tự nhiên). Dịch sau nuôi cấy đem xác định mật độ quang.
b. Thí nghiệm 5: xác định tỷ lệ cơ chất làm môi trường nuôi
Sau khi chọn được môi trường thích hợp thì tỷ lệ cơ chất làm môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Tỷ lệ cơ chất làm môi trường ít hay nhiều đều ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh. Do đó tiến hành nghiên cứu tỷ lệ cơ chất làm môi trường nuôi S.carlsbergensis.
Sau khi chọn được môi trường tự nhiên ở thí nghiệm 4, tiến hành nghiên cứu tỷ lệ cơ chất pha môi trường dịch nuôi cấy tăng sinh với các tỷ lệ là: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% trong 1000ml dịch môi trường, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi S.carlsbergensis thích hợp.
c. Thành phần môi trường
• Thí nghiệm 6: xác định tỷ lệ nguồn cacbon (đường saccharose) bổ
Mặc dù bản thân môi trường nuôi cấy đã cho số lượng tế bào nhất định nhưng để tận thu triệt để lượng sinh khối ta cần bổ sung thêm các nguồn chất dinh dưỡng cần thiết. Có thể nói nguồn cacbon là nguồn năng lượng hàng đầu đối với nấm men, do vậy ta cần nghiên cứu bổ sung thêm nguồn cacbon. Nấm men S.carlsbergensis
thuờng sử dụng nguồn cacbon là các loại đường: saccharose, glucose, maltose,...Nguồn cacbon sử dụng ở đây là đường saccharose. Nấm men
S.carlsbergensis là loài nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20%. Khi nuôi cấy tăng sinh thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%. MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose với các nồng độ lần lượt là: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ đường saccharose bổ sung thích hợp.
• Thí nghiệm 7: xác định tỷ lệ nguồn nitơ (là dịch thủy phân nấm men – theo phụ lục 02) bổ sung vào môi trường tự nhiên nuôi cấy
Nguồn nitơ cũng là nguồn năng lượng rất cần thiết đối với nấm men
S.carlsbergensis, để thu được lượng sinh khối cao và chất lượng tốt ta nên bổ sung thêm nguồn nitơ. Nguồn dinh dưỡng nitơ cần thiết cho các cấu tử của tế bào chứa nitơ như: amino acid, protein, peptid,...Để có thể thu được một lượng lớn sinh khối
S.carlsbergensis trong điều kiện hiếu khí cần phải có nguồn nitơ hữu cơ cũng như vô cơ. Nguồn dinh dưỡng nitơ bổ sung ở đây là dịch tự thủy phân nấm men (sản xuất theo phụ lục 02). Dịch tự thủy phân nấm men được bổ sung với các tỷ lệ: 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1% trong 1000ml dạng dịch MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose theo tỷ lệ nghiên cứu ở thí nghiệm 6, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy
nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ bổ sung nguồn nitơ bổ sung thích hợp.
• Nguồn khoáng:
Nguồn khoáng có ảnh hưởng nhiều nhất đến hoạt động của tế bào nấm men
S.carlsbergensis là kali, photpho, magiê. Trong MTTN thường có đủ các chất khoáng đối với nhu cầu của nấm men S.carlsbergensis. Nên có thể không cần phải bổ sung thêm chất khoáng. Tuy nhiên trong nghiên cứu cũng như trong nuôi cấy tăng sinh để tận thu lượng sinh khối nên bổ sung thêm nguồn phospho kali ở dạng muối phosphat và magiê ở dạng muối sulfat. Muối bổ sung ở đây là K2HPO4 làm nguồn P và K và muối MgSO4 làm nguồn magiê được tiến hành nghiên cứu bổ sung vào môi trường nuôi cấy như thí nghiệm 8 và thí nghiệm 9.
− Thí nghiệm 8: xác định tỷ lệ muối K2HPO4 bổ sung vào môi trường tự
nhiên nuôi cấy
Muối K2HPO4 được bổ sung với các tỷ lệ: 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4% trong 1000ml MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose và dịch tự thủy phân nấm men theo nghiên cứu ở thí nghiệm 6, 7, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi cấy đem xác định mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ bổ sung muối K2HPO4 thích hợp.
− Thí nghiệm 9: xác định tỷ lệ muối MgSO4 bổ sung vào môi trường tự
nhiên nuôi cấy
Muối MgSO4 được bổ sung với các tỷ lệ: 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4% trong 1000ml dịch MTTN được lựa chọn ở thí nghiệm 4 với tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy chọn ở thí nghiệm 5, bổ sung saccharose và dịch tự thủy phân nấm men theo nghiên cứu ở thí nghiệm 6, 7, bổ sung K2HPO4 theo nghiên cứu ở thí nghiệm 8, tiếp đó đem MT khử trùng ở 1atm, 1210C trong 20 phút, để nguội rồi cấy S.carlsbergensis nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, thời gian nuôi, pH môi trường nuôi, nhiệt độ nuôi nghiên cứu ở các thí nghiệm 1, 2, 3. Dịch sau nuôi
cấy đem xác định giá trị mật độ quang, rồi chọn tỷ lệ muối MgSO4 bổ sung thích hợp.
• Các nhân tố vitamin:
Trong MTTN thường có đủ các nhân tố vitamin đối với nhu cầu của nấm men
S.carlsbergensis. Nên có thể không cần phải bổ sung thêm.
d. Điều kiện nuôi cấy thích hợp bằng MTTN
Do MT nuôi cấy thay đổi nên các điều kiện nuôi cấy S.carlsbergensis cũng thay đổi. Do vậy, ta phải nghiên cứu lại một số điều kiện nuôi cấy như: thời gian