Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học:
Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính =
Số mẫu kiểm tra
x 100
Sử dụng hàm chitest xử lý trên phần mềm Excel với mức ý nghĩa α = 0,05 (giá trị P < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens
Để xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens, chúng tôi tiến hành lấy 60 mẫu phân tại hai trại chăn nuôi gà ở cầu Dứa (35 mẫu khỏe mạnh; 25 mẫu nghi bệnh) và 25 mẫu manh tràng tại một cơ sở giết mổ gà ở chợ Vĩnh Hải.
Phân tích 85 mẫu thu được theo phương pháp phân lập vi khuẩn C.
perfringens của Quinn và cộng sự (1994). Qua đó, xác định được mức độ nhiễm vi khuẩn C. perfringens và đánh giá vai trò của bệnh viêm ruột hoại tử trên đàn gà nuôi tại địa bàn thành phố Nha Trang - Khánh Hòa. Kết quả phân lập vi khuẩn C.
perfringens được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân và mẫu manh tràng của gà
Mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỉ lệ dương tính (%) Gà khỏe mạnh 35 3 8,6 Gà nghi bệnh 25 11 44 Phân Tổng mẫu 60 14 23,3 Manh tràng 25 8 32 Tổng chung 85 22 25,9
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, trong 85 mẫu phân và manh tràng mà chúng tôi thu được có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens, chiếm tỷ lệ 25,9%. Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Saad Gharaibeh và cộng sự (2010), khi nhóm tác giả đã nghiên cứu phân lập được 67 chủng vi khuẩn C. perfringens từ 155 mẫu phân gà đem phân tích (chiếm 43,2%). Trong 22 mẫu dương tính với C. perfringens thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn ở mẫu phân gà nghi bệnh là cao nhất và thấp nhất là mẫu phân gà khỏe mạnh (44% so với 8,6%). Sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P < 0,05). Điều này chứng tỏ khi gà mắc bệnh tỷ lệ nhiễm C. perfringens là rất cao. Từ đó có thể nhận thấy, vi khuẩn C.
perfringens đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với kết quả nghiên cứu của Leen Timbermont và cộng sự (2009) khi nhóm tác giả cho rằng tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringensở gà bệnh cao hơn gà khỏe mạnh (chiếm khoảng 55 - 67%).
Từ bảng 3.1 cũng thấy được, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringensở mẫu manh tràng là 32 %. Kết quả này cao hơn kết quả nghiên cứu của Hakan Kalender (2004) và I. Svobodová và cộng sự (2007). Hakan Kalender (2004) đã nghiên cứu phân lập được 8 chủng vi khuẩn C. perfringens trong số 160 mẫu đem phân tích (chiếm 5%). I. Svobodová và cộng sự (2007) thì phân lập được 112 chủng C. perfringens từ 609 mẫu manh tràng (chiếm 18,39%).
So sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn C. perfringensở mẫu phân khỏe mạnh và mẫu manh tràng chúng tôi nhận thấy ở mẫu manh tràng cao hơn so với mẫu phân (32% so với 8,6%). Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P > 0,05). Điều này có thể giải thích như sau: Bình thường, C. perfringens là một loại vi khuẩn đường ruột, nó tồn tại sẵn trong đường tiêu hóa của gà (chủ yếu là manh tràng), khi gặp các điều kiện thuận lợi như thời tiết hoặc khẩu phần ăn thay đổi đột ngột sẽ làm giảm sức đề kháng của con vật, tạo điều kiện cho cầu trùng gây bệnh. Đây là thời điểm tốt nhất để C. perfringens sinh sôi nẩy nở, tăng về số lượng và gây bệnh cho động vật. Tuy nhiên, khi vi khuẩn di chuyển xuống hậu môn (chứa phân), tại đây môi trường không thuận lợi cho vi khuẩn phát triển (pH thấp). Lúc này, một số vi khuẩn có thể bị chết. Do đó, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân sẽ thấp hơn so với mẫu manh tràng.
Mặt khác, tỷ lệ nhiễm C. perfringens cao đối với mẫu manh tràng cũng cần được chú ý. Bởi đây là nguồn vi khuẩn rất dễ nhiễm vào thịt gây ngộ độc thực phẩm cho người sử dụng.
Từ kết quả trên có thể nhận thấy vi khuẩn C. perfringens là tác nhân phổ biến gây nên bệnh viêm ruột hoại tử ở gà.
3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens
3.2.1. Hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn
Sau khi làm tiêu bản nhuộm Gram các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Fluid Thioglycolate, tiến hành soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100X) để kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu của C. perfringens. Chúng tôi quan sát được tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens đều là trực khuẩn bắt màu thuốc nhuộm Gram dương (màu tím), chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc song song, một số kết thành dạng chuỗi ngắn. Sở dĩ, C. perfringens bắt màu thuốc nhuộm là do C. perfringens là vi khuẩn Gram dương, có cấu tạo thành tế bào peptidoglycan dày. Trong quá trình nhuộm, tế bào được xử lý trước tiên với crytal violet rồi với tinh thể iod (một thành phần của dung dịch lugol). Kết quả là có sự tạo thành phức chất tím tinh thể iod bên trong tế bào. Tiếp tục xử lý với cồn làm các lỗ trên thành peptidoglycan se lại giữ phức tím kết tinh; do đó khi nhuộm màu fuchsin bổ sung thì thành tế bào không ăn thêm màu mới mà vẫn giữ màu tím của crytal violet.
3.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động của C. perfringens
Tiến hành làm tiêu bản giọt treo như đã trình bày ở phần 2.4.4, đem soi dưới kính hiển vi điện tử với vật kính dầu (100X), chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều có dạng hình que ngắn, không di động.
Hình 3.2. Vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi
3.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra 22 chủng C. perfringens phân lập được trên các môi trường đặc hiệu, môi trường đường để kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn. Kết quả thu được như sau:
Trên môi trường Fluid Thioglycolate: cấy vi khuẩn C. perfringens vào môi trường Fluid Thioglycolate, sau 6 - 8 giờ nuôi cấy vi khuẩn trong tủ ấm ở 37oC, 10% CO2, vi khuẩn mọc rất tốt, làm đục đều môi trường.
Hình 3.3. Vi khuẩn trên môi trường Fluid Thioglycolate
Đối chứng Dương tính
Trên môi trường SPS agar: lấy dịch khuẩn nuôi cấy trên Fluid Thioglycolate cấy ria sang SPS agar, vi khuẩn phát triển tạo thành khuẩn lạc tròn, đen sau 24 giờ nuôi cấy trong túi yếm khí (tủ ấm 37oC, 10% CO2).
Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS agar
Trên môi trường thạch máu: Khi ria vi khuẩn lên môi trường thạch máu, sau 24 giờ vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn, nhẵn bóng, có hai vòng dung huyết xung quanh (hiện tượng dung huyết beta).
Trên môi trường Egg yolk, sau 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở tủ ấm 37oC, 10% CO2, 100% các chủng vi khuẩn kiểm tra phát triển sinh men lecithinase, thủy phân lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
Hình 3.6. Khuẩn lạc trên môi trường Egg yolk
Phản ứng CAMP test: Chúng tôi tiến hành đọc kết quả phản ứng CAMP test, sau 18 - 24 giờ nuôi cấy C. perfringens trong điều kiện yếm khí, thì nhận thấy 100% các chủng kiểm tra đều có phản ứng dương tính khi xuất hiện dung huyết hình mũi tên trên bề mặt thạch. Nhân tố protein được tiết ra bởi vi khuẩn S. agalactiae có vai trò tăng cường hoạt tính của alpha toxin và theta toxin. Đây là hai yếu tố đóng vai trò quan trọng gây ra hiện tượng dung huyết. Do đó, tăng cường điều kiện tiếp xúc và xúc tác thủy phân thành phần chủ yếu của màng hồng cầu là sphingomyelin làm hồng cầu trở nên dễ vỡ tạo nên hiện tượng dung huyết mạnh hơn ở vùng tiếp xúc giữa hai đường cấy của hai loài vi khuẩn.
Hình 3.7. Phản ứng CAMP test Streptococus agalactiae C . pe rf ri nge ns
Trên các môi trường đường (glucose, lactose, maltose, sucrose), sau 24 giờ nuôi cấy, 100% các chủng vi khuẩn kiểm tra đều lên men đường làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng. Vi khuẩn sử dụng đường tạo thành các sản phẩm trung gian có tính axit làm giảm pH của môi trường. Môi trường chuyển sang màu vàng với chỉ thị phenol red. Đồng thời, trên các môi trường đường xuất hiện các vết thạch bị nứt vỡ, chứng tỏ tất cả các chủng kiểm tra đều có khả năng sinh hơi.
Vi khuẩn không có khả năng lên men đường Mannitol - motility.
Trên môi trường Litmus milk, tất cả 22 chủng vi khuẩn C. perfringens kiểm tra đều lên men đường lactose, làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu trắng với chỉ thị pH litmus sau 24 - 28 giờ trong tủ ấm 37oC, 10% CO2.
Đối chứng Glucose (+); Sucrose (+); Maltose (+); Lactose (+); Mannitol (-); Litmus milk (+).
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C.perfringens STT Tính chất Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ (%) 1 Gram dương 22 22 100 2 Di động 22 22 0 3 Fluid Thioglycolate 22 22 100 4 SPS agar 22 22 100 5 Thạch máu 22 22 100
6 Lên men Glucose 22 22 100
7 Lên men Sucrose 22 22 100
8 Lên men Maltose 22 22 100
9 Lên men Lactose 22 22 100
10 Lên men Mannitol - motility 22 0 0
11 Sinh hơi 22 22 100
12 Litmus milk 22 22 100
13 Egg yolk 22 22 100
14 CAMP test 22 22 100
Qua bảng 3.2 cho thấy, 100% các chủng kiểm tra đều không có khả năng di động và không lên men đường mannitol. Trên các môi trường đường: glucose, lactose, maltose, sucrose: sau 24 giờ nuôi cấy, tất cả các chủng vi khuẩn đều phát triển, lên men đường làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng trong điều kiện yếm khí với chỉ thị phenol red. Tất cả môi trường đều xuất hiện các vết thạch bị nứt, vỡ chứng tỏ tất cả các chủng đều có khả năng sinh hơi. Mặt khác, trên các môi trường đặc trưng thì tất cả các chủng được kiểm tra đều cho kết quả dương tính.
3.4. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR
Bằng phương pháp test sinh hóa, chúng tôi đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn C. perfringens. Tiến hành giám định lại loài vi khuẩn này theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR (Karl Mullis và cộng sự, 1985). Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA Chú thích:
M: Marker
(+): Đối chứng dương (-): Đối chứng âm
1, 2, 3, 6, 7, 12, 13, 14: các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập được.
Kết quả hình 3.9 cho thấy, các đoạn sản phẩm nằm ở vạch kích thước 658 bp tương ứng với kích thước sản phẩm cặp mồi của đoạn gene 16S RNA do Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung đưa ra. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA cũng được ghi lại ở bảng 3.3.
658 bp
100 bp 200 bp 400 bp 600 bp
Bảng 3.3. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA
Nguồn gốc chủng Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ (%)
Mẫu phân gà khỏe mạnh 3 2 67
Mẫu phân gà nghi bệnh 11 11 100
Mẫu manh tràng 8 7 88
Tổng 22 20 91
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, trong 22 chủng vi khuẩn C. perfringens đem giám định có 20 chủng dương tính với gene 16S RNA, 2 chủng âm tính. Từ kết quả này cho thấy độ chính xác trong phương pháp phân lập vi khuẩn bằng giám định các đặc tính sinh hóa đạt 91%. Có thể giải thích kết quả này như sau: Hiện nay, có một số loại vi khuẩn cũng có đặc tính sinh vật hóa học tương tự vi khuẩn C. perfringens, do vậy trong quá trình phân lập có thể dẫn đến nhầm lẫn. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận những ưu thế của phương pháp truyền thống - Phân lập và giám định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Vì từ phương pháp này có thể tách được các chủng vi khuẩn thuần khiết với chi phí thấp. Và cũng từ kết quả nghiên cứu trên, chúng ta có thể sử dụng phương pháp PCR trong việc phát hiện nhanh loài vi khuẩn với độ chính xác khá cao.
3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR thuật Multiplex PCR
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε), iota (i), beta2, enterotoxin, theta,…Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E).
Để định type độc tố của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành chọn 20 chủng C. perfringens dương tính với gene 16S RNA của vi khuẩn để tiến hành xác định gene mã hóa sản sinh các loại độc tố chính của vi khuẩn bằng Multiplex PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999). Từ kích thước của các vạch sản phẩm thu được, chúng tôi xác định gene mã hóa độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được, từ đó định type
độc tố của vi khuẩn. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringens
Chú thích:
M: Marker
(+): đối chứng dương (-): đối chứng âm
2, 3, 6, 7: các chủng vi khuẩn phân lập được
Bảng 3.4. Kết quả định type độc tố các chủng vi khuẩn C. perfringens
Type A Type B Type C Type D Type E Nguồn gốc chủng Số chủng định type + % + % + % + % + % Mẫu phân gà khỏe 2 2 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Mẫu phân gà nghi bệnh 11 11 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Mẫu manh tràng 7 7 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 20 20 100 0 0 0 0 0 0 0 0 100 bp 200 bp 300 bp Cpa (324 bp) Etx (655 bp)
Kết quả ở hình 3.10 và bảng 3.4 cho thấy, các đoạn sản phẩm đều nằm ở vạch kích thước 324 bp tương ứng với kích thước của đoạn gene mã hóa độc tố alpha mà nhà thiết kế mồi đưa ra. Nghĩa là, tất cả 20 chủng vi khuẩn C. perfringens mà chúng tôi phân lập được đều mang gene mã hóa sản sinh độc tố alpha, không có chủng nào mang gene mã hóa sản sinh độc tố tố beta, epsilon và iota. Với kết quả này, chúng tôi rút ra kết luận, tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều thuộc type A. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với các nghiên cứu của một số tác giả ở nước ngoài. Theo Hakan Kalender (2004), 6/8 (chiếm 75%) chủng vi khuẩn phân lập được thuộc type A. Theo kết quả nghiên cứu của Effat và cộng sự (2007); Saad Gharaibeh và cộng sự (2010) thì 100% các chủng vi khuẩn C. perfringens đều
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
1) Đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens và nhận thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu phân và mẫu manh tràng là 25,9%. Tỷ lệ vi khuẩn C. perfringens phân lập được ở mẫu phân là 23,3%; trong đó mẫu phân gà nghi bệnh là 44% cao hơn gà khỏe mạnh (8,6%). Tỷ lệ vi khuẩn C. perfringens phân lập được ở mẫu manh tràng là 32%.
2) Tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều mang đầy đủ các đặc tính sinh vật hóa học như các tài liệu đã mô tả.
3) Tiến hành giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR và nhận diện được 20 trong số 22
chủng C.perfringens dương tính với đoạn gene 16S RNA. 4) Đã tiến hành định type độc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập được và
nhận thấy tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều thuộc type A.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi có một số đề xuất: