thuật Multiplex PCR
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε), iota (i), beta2, enterotoxin, theta,…Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E).
Để định type độc tố của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành chọn 20 chủng C. perfringens dương tính với gene 16S RNA của vi khuẩn để tiến hành xác định gene mã hóa sản sinh các loại độc tố chính của vi khuẩn bằng Multiplex PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999). Từ kích thước của các vạch sản phẩm thu được, chúng tôi xác định gene mã hóa độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được, từ đó định type
độc tố của vi khuẩn. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringens
Chú thích:
M: Marker
(+): đối chứng dương (-): đối chứng âm
2, 3, 6, 7: các chủng vi khuẩn phân lập được
Bảng 3.4. Kết quả định type độc tố các chủng vi khuẩn C. perfringens
Type A Type B Type C Type D Type E Nguồn gốc chủng Số chủng định type + % + % + % + % + % Mẫu phân gà khỏe 2 2 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Mẫu phân gà nghi bệnh 11 11 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Mẫu manh tràng 7 7 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 20 20 100 0 0 0 0 0 0 0 0 100 bp 200 bp 300 bp Cpa (324 bp) Etx (655 bp)
Kết quả ở hình 3.10 và bảng 3.4 cho thấy, các đoạn sản phẩm đều nằm ở vạch kích thước 324 bp tương ứng với kích thước của đoạn gene mã hóa độc tố alpha mà nhà thiết kế mồi đưa ra. Nghĩa là, tất cả 20 chủng vi khuẩn C. perfringens mà chúng tôi phân lập được đều mang gene mã hóa sản sinh độc tố alpha, không có chủng nào mang gene mã hóa sản sinh độc tố tố beta, epsilon và iota. Với kết quả này, chúng tôi rút ra kết luận, tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều thuộc type A. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với các nghiên cứu của một số tác giả ở nước ngoài. Theo Hakan Kalender (2004), 6/8 (chiếm 75%) chủng vi khuẩn phân lập được thuộc type A. Theo kết quả nghiên cứu của Effat và cộng sự (2007); Saad Gharaibeh và cộng sự (2010) thì 100% các chủng vi khuẩn C. perfringens đều
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
1) Đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens và nhận thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu phân và mẫu manh tràng là 25,9%. Tỷ lệ vi khuẩn C. perfringens phân lập được ở mẫu phân là 23,3%; trong đó mẫu phân gà nghi bệnh là 44% cao hơn gà khỏe mạnh (8,6%). Tỷ lệ vi khuẩn C. perfringens phân lập được ở mẫu manh tràng là 32%.
2) Tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều mang đầy đủ các đặc tính sinh vật hóa học như các tài liệu đã mô tả.
3) Tiến hành giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR và nhận diện được 20 trong số 22
chủng C.perfringens dương tính với đoạn gene 16S RNA. 4) Đã tiến hành định type độc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập được và
nhận thấy tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều thuộc type A.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi có một số đề xuất:
- Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu trên nhiều địa bàn và thu thập mẫu với số lượng nhiều hơn để có được kết quả chính xác hơn.
- Có thể áp dụng phương pháp xác định gene 16S RNA để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn C. perfringens.
- Tiếp tục nghiên cứu vai trò gây bệnh của vi khuẩn C. perfringens trên nhiều đối tượng khác nhau, qua đó có thể đề ra biện pháp phòng và trị thích hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ thủy sản (2004), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
2. Đào Trọng Đạt, Trần Thị Hạnh, Đặng Phương Kiệt (1998), Phân lập vi khuẩn C. perfringens tại một số hộ gia đình của tỉnh Vĩnh Phú, Tạp chí thông tin Y dược số 10, Bộ Y tế.
3. Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Chú giải di truyền học, Nhà xuất bản Giáo dục.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục, Trang 190 - 199.
5. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên (2009), Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ bò và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Nội và vùng phụ cận, Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVI, số 4.
6. Lê Lập, Nguyễn Đức Tân (2006), Phân lập và xác định type độc tố (toxinotype) của vi khuẩn Clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn 2007, số 9.
7. Phạm Hồng Sơn (2002), Vi sinh vật thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Trần Linh Thước (2004), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh.
9. Trần Thị Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2000), Cơ sở di truyền và công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 157 - 171.
Tài liệu tiếng Anh
10. Anders Johansson. (2006), Clostridium perfringens the causal agent of necrotic enteritis in poultry, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science Department of Biomedical Sciences and Veterinary Public Health Uppsala.
11. Annamari Heikinheimo. (2008), Diagnostic and molecular epidemiology of cpe- positive C. perfringens type A.
12. Anthony L. Keyburn và cộng sự. (2008), NetB, a New Toxin That Is Associated with Avian Necrotic Enteritis Caused by Clostridium perfringens, 1913 - 1927. 13. Cato, E., George, WL, and Fine gold, S. (1986), Genus Clostridium, Beryey’s
Manual of systematic bacteriology 2: 1140 - 1200.
14. Charles L. Hatheway. (1990), Toxigenic Clostridia, Clinical Microbiology Reviews, Jan, pp. 66 - 98.
15. Effat và cộng sự. (2007), Characterization of Clostridium perfringens
feildisolates, implicated in necrotic enteritis outbreaks on private broiler farms in Cairo, by Multiplex PCR, African Journal of Microbiology Research, pp. 029 - 032. 16. Hakan Kalender. (2004), Isolation of Clostridium perfringens from Chickens
and Detection of the Alpha Toxin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR),
Veterinary control and research institute, 23100.
17. Hofshagen, H. Stenwig. (1992), Toxin production by C. perfringens isolated from broiler chickens and capercaillies (Tetrao Urogallus), With and without necrotizing enteritis, National veterinary institute, Oslo, Norway, 36 (4): 837- 43. 18. Ilenia Drigo, Fabrizio Agnoletti, Cosetta Bacchin,Francesca Bettini, Monia
Cocchi, Tiziana Ferro, Barbara Marcon, Luca Bano. (2008), Toxin genotyping of Clostridium perfringens field strains isolated from healthy and diseased chickens, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Treviso, Italy. 19. I. Svobodová, I. Steinhauserová, M. Nebola. (2007), Incidence of C.
perfringens in Broiler Chickens in the Czech Republic, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Czech Republic.
20. Jesus G.M. Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V. (1999), Use of 16S - 23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity, Journal Microbiol Methods, 36: 55 - 64.
21. Journal of Microbiology Research, pp. 029 - 032.
22. Leen Timbermont, Anouk Lanckriet, Frank Pasmans, Freddy Haesebrouck. (2009), Intra - species growth - inhibition by C. perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers, Journal Article, Ghent University- 524628.
23. Long, J.R. (1973), Necrotic enteritis in broiler chickens. I. A review of the literature and the prevalence of the disease in Ontario, Canadian Journal of Comparative Medicine, 37: 302 - 308.
24. McDonel, J. L. (1980), Clostridium perfringens toxins (type A, B, C, D, E),
Pharmacol, Ther, 10: 617 - 655.
25. Qiyi Wen và Bruce A. McClalane. (2004), Detection of Enterotoxingenic
Clostridium perfringens Type A Isolates in American Retail Foods.
26. Quinn P.J., M.E. Carter, B. Markey, G.R. Carter. (1994), Clostridium species, Clinal Verternary Microbiology, Wolfe Publishing,191 - 208.
27. Rocio Crespo và cộng sự (2007), Toxinotypes of Clostridium perfringens
isolated from sick and healthy avian species, J Vet Diagn Invest, 19: 329 - 333.
28. Saad Gharaibeh, Rami Al Rifai and Ahmad AL - Majali. (2010), Molecular typing and antimicrobial susceptibility of C. perfringens from broiler chickens,
Department of Pathology and Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine, Jordan University of Science and Technology, Irbid, Jordan, 22110.
29. Shimizu, T., Ohtani, K., Hirakawa, H., Ohshima, K., Yamashita, A., Shiba, T., Ogasawara, N., Hattori, M., Kuhara, S. & Hayashi, H. (2002), Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh - eater, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 99: 996 - 1001. 30. SIPOS W. ; FISCHER L. ; SCHINDLER M. ; SCHMOLL F. (2003), Genotyping of
31. Songer J.G. and Dawn Bueschel. (1999), Multiplex PCR Procedure for Genotypeing Clostridium perfringens, Dep. Of Veterinary Science, University of Arizona, Tucson, Dec16, 1999.
Một số trang web điện tử đã tra cứu
32. http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/101/necrotic-enteritis 33. http://www.yduocngaynay.com/88YSH_LKCuong_HumanMicrobiome.htm 34. http://www.worldpoultry.net/background/new-discovery-scientiststake-fresh- look-at- poultry-disease-2194.html 35. http://cctytg.wordpress.com/2010/10/16/452/ 36. http://www.lrctnu.edu.vn:8080/gsdl/collect/luanvanl/index/assoc/HAS 0199.dir/doc.pdf 37. http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction 38. http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR
PHỤ LỤC
THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
1. Fluid Thyoglycolate medium:
Thành phần Lượng
Peptone from Casein 15,0 g
Yeast extract 5,0 g D (+) Glucose 5,5 g L - Cystine 0,5 g Sodium Chloride 2,5 g Sodium Thyoglycolate 0,5 g Resazurin Sodium 0,001 g Agar - agar 0,75 g pH 7,1 ± 0,2/25oC
Cách pha: Pha 30 gam môi trường trong 1l nước cất, hấp 121oC trong 15 phút.
2. SPS Agar (Perfringens Slection Agar)
Thành phần Lượng
Tryptose 15,0 g
Peptone from Soymeal 5,0 g
Yeast extract 5,0 g
Sodium disulfite 1,0 g
Ammonium iron (III) Citrate 1,0 g
Agar - agar 15,0 g
pH 7,4 ± 0,2/25oC
3. BHI (Brain Heart Broth)
Thành phần Lượng
Nutrient substrate (extract of Brain DNA Heart
DNA Peptone) 27,5 g
D (+) Glucose 2,0 g
Sodium Chloride 5,0 g
Di - Sodium Hydrogen Phosphate 2,5 g
pH 7,4 ± 0,2/25oC
Cách pha: Cân 37 g môi trường trong 1 l nước cất, hấp 12oC trong 15 phút.
4. Thạch máu
Cân 37 g môi trường BHI cho vào 1 l nước cất, bổ sung thêm 16% agar. Sau khi hấp 121oC trong 15 phút, để nguội khoảng 45 - 50oC bổ sung thêm 5 - 10% máu thỏ. Sau đó, rót ra các đĩa petri.
5. Các môi trường đường
Các môi trường đường có thành phần tương tự nhau:
Thành phần Lượng
Peptone 10,0 g
NaCl 5,0 g
Phenol red 0,2% 12,5 ml
Glucose (Maltose, Saccharose, Lactose) 10,0 g
Agar - agar 5,0 g
pH 7,2
Cách pha: Cân chính xác khối lượng các thành phần hóa chất trên hòa tan trong 1 l nước. Hấp các môi trường đường ở 100oC trong 30 phút.
6. Litmus Milk
Thành phần Lượng
Skim milk powder 100,0 g
Litmus 0,5 g
Sodium disulfile 0,5 g
pH 6,8 ± 0,2/25oC
Cách pha: cân 100 g môi trường trong 1 l nước cất, hấp 121oC trong 15 phút.
7. Egg yolk Agar Base, Modifed
Thành phần Lượng
Casein enzymic hydrolysate 15,0 g Papaic digest of soyabean meal 5,0 g
Yeast extract 5,0 g Sodium Chloride 5,0 g L - Systine 0,4 g Hemin 0,005 g Vitamin K1 0,01 g Agar - agar 20 g pH 7,5 ± 0,2
Cách pha: cân 50,4 g môi trường trên hòa tan trong 900 ml nước cất, hấp ở 121oC trong 15 phút. Để nguội đến 50 - 55oC, thêm 100 ml lòng đỏ trứng lắc đều sau đó rót ra các đĩa petri.
8. Môi trường Manitol – Motility Thành phần Lượng Peptone 2 g Mannitol 0,4 g Phenol red 0,2% 4 ml KNO3 0,35 g Agar - agar 0,5 g pH 7,5
Cách pha: Cân các thành phần môi trường như trên hòa tan trong 20 ml nước cất vô trùng, hấp 121oC trong 15 phút. Sau khi để nguội khoảng 40 - 45oC, rót vào các ống nghiệm.