Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm ba bước:
Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR
1-Biến tính, 2-Lai, 3-Kéo dài, 4-Lặp lại 1 chu kỳ 3 bước như trên
Bước 1 (Giai đoạn biến tính - denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94oC - 95oC trong vòng 30
giây - 1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép tách nhau ra hoàn toàn tạo thành các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme DNA polymerase xúc tác tổng hợp.
Bước 2 (Giai đoạn lai - hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các đoạn mồi bắt cặp với các trình tự thích hợp trên các phân tử DNA làm khuôn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng 45oC - 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
Bước 3 (Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài - elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA taq polymerase bền nhiệt hoạt động (tổng hợp DNA từ những tiền chất dNTP). Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 3 - 5 phút.
Để bắt đầu một chu kì tiếp theo, nhiệt độ được nâng lên 94oC trong khoảng 30 giây - 5 phút để các mẫu ngắn DNA mạch kép tách nhau ra. Các sợi đơn này lại trở thành khuôn cho một vòng tổng hợp DNA khác. Một chu kì bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kì sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.
1.4.4. Các hạn chế của phản ứng PCR
Hiện nay, PCR được ứng dụng rất rộng rãi để giải quyết nhiều vấn đề trong sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, virus, định type, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động vật và thực vật. Có thể nói PCR đóng vai trò cách mạng hóa trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gene. Sức mạnh của PCR kết hợp với các kỹ thuật khác của tạo dòng phân tử đã giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới. Lợi ích của PCR rất to lớn bởi thời gian thực hiện rất nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm; thực hiện đơn giản và ít tốn kém (thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời); yêu cầu độ tinh sạch của mẫu dùng trong kỹ thuật này không cần cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại
của người đã chết). Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả. Có thể kể đến ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:
Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này
Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm (tubes, tips, pipetters, bench top),… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Vì vậy, kết quả thí nghiệm sẽ không chính xác.
Luôn luôn sử dụng ống đối chứng âm: Nếu vẫn thu được kết quả từ ống nghiệm này chứng tỏ mẫu đã bị nhiễm.
Để hạn chế sự nhiễm, người ta có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp như sau:
Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
Dùng tia tử ngoại (tia UV) để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.
Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với 1, 2 lần thao tác.
Lưu ý rằng phải sử dụng găng tay cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet.
Các sai sót gây ra do Taq polymerase
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức, …
1.4.5. Phản ứng Multiplex PCR
Phản ứng Multiplex PCR là một dạng cải tiến của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng hay nói cách khác Multiplex PCR là phản ứng PCR khuếch đại được nhiều đoạn DNA khác nhau, bằng cách sử dụng những cặp mồi chuyên biệt cho những gene khác nhau. Như vậy, chỉ cần trong một phản ứng ta có thể xác định đồng thời được nhiều tác nhân vi sinh vật dựa trên nguyên lý sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích của chúng.
Để thiết kế được Multiplex PCR thì quan trọng nhất là phải làm sao thiết kế được các mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, các mồi này không bắt cặp với nhau và độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm mà vẫn tương đương như độ nhạy của PCR đơn mồi.
Từ các mô tả đầu tiên về nó năm 1988, đến nay phương pháp này đã áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm có phân tích mất đoạn,
đột biến, đa hình hoặc trong các phương pháp định lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT - PCR).
1.5. Điện di - Phát hiện sản phẩm PCR [2], [9]
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Nguyên tắc điện di:
Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di. Qua đó, ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gene riêng rẽ. Trên điện trường, các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn. Vì vậy, tuỳ theo kích thước phân tử và tuỳ theo mức độ cần phân tách mà người ta chọn loại gel và nồng độ gel thích hợp để dùng trong điện di.
Có hai loại vật liệu làm gel được sử dụng phổ biến trong điện di, đó là agarose và polyacrylamid. Trong đó, gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưng khoảng kích thước DNA có thể phân tích hẹp. Vì vậy, điện di trên gel polyacrylamid có thể phân tách được các phân đoạn DNA khác nhau thậm chí chỉ một cặp nucleotide (1 bp) duy nhất, nhưng thường chỉ để phân tích các đoạn DNA kích thước vài trăm bp. Còn gel agarose có khả năng phân tách thấp hơn đối với các phân đoạn DNA kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các phân đoạn DNA kích thước lớn tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp).
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử DNA có thể quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang Ethidium bromide. Chất này vào sau khi gel đã nấu
để nguội đến 45oC, nó có tác dụng gắn kết với DNA bằng cách cài vào khe ở giữa các nucleotide và chúng sẽ được phát sáng khi soi dưới tia UV (bước sóng khoảng 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ phân hoặc phủ tạng của gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm lấy mẫu: Lấy mẫu tại một cơ sở giết mổ gà ở chợ Vĩnh Hải và hai trại chăn nuôi gà ở thành phố Nha Trang.
- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung, Km 4, Đường 2/4, phường Vĩnh Hòa, Nha Trang, Khánh Hòa.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 15. 03. 2011 đến 16. 06. 2011.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
- Máy ly tâm, máy PCR, máy vortex, tủ lạnh, tủấm CO2, tủ cấy, thiết bị điện di, kính hiển vi, nồi hấp…
- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, eppendorf, đầu côn…
2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: DNA marker, Ethidium bromide, dung dịch đệm Buffer, enzyme Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl, mồi đặc hiệu, nước siêu sạch...
- Môi trường sử dụng: Môi trường Fluid Thioglycolate, SPS, Egg yolk (lòng đỏ trứng), Litmus milk, Mannitol - motility, thạch máu BHI, các môi trường đường glucose, maltose, lactose, sucrose…
- Các loại thuốc nhuộm Gram: Crytal violet, lugol, ethanol, fuchsin.
2.4. Phương pháp nghiên cứu2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu phân và mẫu manh tràng tại 2 trang trại nuôi gà và 1 cơ sở giết mổ gà ở thành phố Nha Trang. Trong đó, mẫu phân lấy ở gà nghi bệnh và gà khỏe mạnh. Còn mẫu manh tràng chỉ lấy ở gà khỏe mạnh.
+ Gà nghi bệnh là gà có các triệu chứng biểu hiện: Suy nhược, xù lông, biếng ăn, nhắm mắt lại, bất động, tiêu chảy, phân có lẫn máu và khi mổ khám thì thấy có các tổn thương: Ruột non thường dày lên và phình to ra, niêm mạc ruột có nhiều chất nhầy, có hiện tượng trào ngược dịch mật nếu ruột non bị ảnh hưởng, ruột bị mất nước trầm trọng và có thể thối rửa nhanh chóng, gan và ruột có hiện tượng xuất huyết và hoại tử.
+ Ngược lại, gà khỏe mạnh là gà không mang các triệu chứng và bệnh tích nói trên. Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào hậu môn gà rồi cho vào lọ chứa môi trường vận chuyển (STUART transport medium) bảo quản lạnh, vận chuyển càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
Mẫu manh tràng: Dùng pank, kéo sạch cắt 1 phần hoặc lấy nguyên phủ tạng cho vào dung dịch glycerol 10% hoặc cho vào túi polymer. Bảo quản trong phích đá và vận chuyển càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học sinh vật hóa học
Chúng tôi áp dụng phương pháp thường quy phân lập của Quinn và cộng sự (1994) [26]. Quy trình phân lập Mẫu Phân lập C. perfringens Fluid Thiogly - colate Môi trường đặc hiệu (SPS agar) Chọn khuẩn lạc đen tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn
Thuyết minh quy trình:
- Mẫu phân và mẫu bệnh phẩm thu được đem nâng lên ở nhiệt độ thường. Sau đó cấy tăng sinh trên môi trường Fuid Thioglycolate và lắc đều. Sau đó đem đun ở 75 - 80oC trong 15 - 30 phút để hạn chế sự tạp nhiễm các vi khuẩn khác cũng như loại bớt O2 trong môi trường nuôi cấy. Ủ trong 6 - 8 giờ ở điều kiện yếm khí (tủ ấm 37oC, 10% CO2).
- Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ canh khuẩn ở môi trường Fuid Thioglycolate đem ria trên bề mặt SPS agar. Nuôi trong điều kiện yếm khí (túi yếm khí 90% N2, 10% CO2) ở 37oC, sau 24 - 28 giờ kiểm tra kết quả.
- Dùng que cấy chọn khuẩn lạc đặc trưng: tròn và đen trên môi trường SPS agar ria trên bề mặt thạch máu. Nuôi trong điều kiện yếm khí (túi khí 90% N2, 10% CO2) ở 37oC, sau 24 - 28 giờ kiểm tra kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường thạch máu tròn bóng và gây dung huyết thạch máu. Như vậy, trên môi trường thạch máu chúng tôi kiểm tra được khả năng dung huyết của C. perfringens.
- Sau đó, tiến hành giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens.
2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens
Để kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens, chúng tôi tiến hành chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu (xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết) cấy lên các môi trường sinh hóa:
Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, sucrose.
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, sau đó nuôi trong điều kiện yếm khí (để tủ ấm 37oC, 10% CO2). Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại.
Kiểm tra khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi trên các môi trường đường, nếu thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên và ngược lại.
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường chích sâu xuống đáy ống nghiệm, nuôi trong điều kiện yếm khí. Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả.
+ Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều.
+ Vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy. + Vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Litmus milk
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, sau 24 - 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn lên men lactose, làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu trắng với chỉ thị pH litmus.
Kiểm tra khả năng lên men lecithinase trên môi trường Egg yolk
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, đặt trong tủ ấm CO2 ở 37oC, sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase