2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu phân và mẫu manh tràng tại 2 trang trại nuôi gà và 1 cơ sở giết mổ gà ở thành phố Nha Trang. Trong đó, mẫu phân lấy ở gà nghi bệnh và gà khỏe mạnh. Còn mẫu manh tràng chỉ lấy ở gà khỏe mạnh.
+ Gà nghi bệnh là gà có các triệu chứng biểu hiện: Suy nhược, xù lông, biếng ăn, nhắm mắt lại, bất động, tiêu chảy, phân có lẫn máu và khi mổ khám thì thấy có các tổn thương: Ruột non thường dày lên và phình to ra, niêm mạc ruột có nhiều chất nhầy, có hiện tượng trào ngược dịch mật nếu ruột non bị ảnh hưởng, ruột bị mất nước trầm trọng và có thể thối rửa nhanh chóng, gan và ruột có hiện tượng xuất huyết và hoại tử.
+ Ngược lại, gà khỏe mạnh là gà không mang các triệu chứng và bệnh tích nói trên. Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào hậu môn gà rồi cho vào lọ chứa môi trường vận chuyển (STUART transport medium) bảo quản lạnh, vận chuyển càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
Mẫu manh tràng: Dùng pank, kéo sạch cắt 1 phần hoặc lấy nguyên phủ tạng cho vào dung dịch glycerol 10% hoặc cho vào túi polymer. Bảo quản trong phích đá và vận chuyển càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học sinh vật hóa học
Chúng tôi áp dụng phương pháp thường quy phân lập của Quinn và cộng sự (1994) [26]. Quy trình phân lập Mẫu Phân lập C. perfringens Fluid Thiogly - colate Môi trường đặc hiệu (SPS agar) Chọn khuẩn lạc đen tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn
Thuyết minh quy trình:
- Mẫu phân và mẫu bệnh phẩm thu được đem nâng lên ở nhiệt độ thường. Sau đó cấy tăng sinh trên môi trường Fuid Thioglycolate và lắc đều. Sau đó đem đun ở 75 - 80oC trong 15 - 30 phút để hạn chế sự tạp nhiễm các vi khuẩn khác cũng như loại bớt O2 trong môi trường nuôi cấy. Ủ trong 6 - 8 giờ ở điều kiện yếm khí (tủ ấm 37oC, 10% CO2).
- Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ canh khuẩn ở môi trường Fuid Thioglycolate đem ria trên bề mặt SPS agar. Nuôi trong điều kiện yếm khí (túi yếm khí 90% N2, 10% CO2) ở 37oC, sau 24 - 28 giờ kiểm tra kết quả.
- Dùng que cấy chọn khuẩn lạc đặc trưng: tròn và đen trên môi trường SPS agar ria trên bề mặt thạch máu. Nuôi trong điều kiện yếm khí (túi khí 90% N2, 10% CO2) ở 37oC, sau 24 - 28 giờ kiểm tra kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường thạch máu tròn bóng và gây dung huyết thạch máu. Như vậy, trên môi trường thạch máu chúng tôi kiểm tra được khả năng dung huyết của C. perfringens.
- Sau đó, tiến hành giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens.
2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens
Để kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens, chúng tôi tiến hành chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu (xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết) cấy lên các môi trường sinh hóa:
Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, sucrose.
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, sau đó nuôi trong điều kiện yếm khí (để tủ ấm 37oC, 10% CO2). Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại.
Kiểm tra khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi trên các môi trường đường, nếu thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên và ngược lại.
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường chích sâu xuống đáy ống nghiệm, nuôi trong điều kiện yếm khí. Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả.
+ Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều.
+ Vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy. + Vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Litmus milk
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, sau 24 - 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn lên men lactose, làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu trắng với chỉ thị pH litmus.
Kiểm tra khả năng lên men lecithinase trên môi trường Egg yolk
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, đặt trong tủ ấm CO2 ở 37oC, sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc và ngược lại.
Phản ứng CAMP test
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc S. agalactiae cấy một đường vào môi trường thạch máu. Sau đó, lấy khuẩn lạc C. perfringens cấy một đường vuông góc với đường đã cấy. Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện yếm khí (tủ ấm 37oC, 10% CO2). Sau 18 - 24 giờ tiến hành đọc kết quả, phản ứng dương tính khi xuất hiện dung huyết hình mũi tên trên bề mặt thạch ở chổ tiếp xúc giữa vi khuẩn C. perfringens và S. agalactiae.
2.4.4. Xác địnhđặc tính hình thái của C. perfringens
Kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram [1], [8].
Làm tiêu bản cố định phiến phết: Dùng que cấy lấy một giọt canh khuẩn dàn đều lên bề mặt lam kính sạch. Cố định tiêu bản bằng cách hơ lam kính 2 - 3 lần qua ngọn lửa đèn cồn. Sau đó tiến hành nhuộm.
Tiến hành nhuộm:
+ Phủ dung dịch crytal violet lên tiêu bản trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước. + Phủ dung dịch lugol lên tiêu bản trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước. + Dùng cồn 95% nhỏ từ từ lên tiêu bản đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (lưu ý là thời gian tẩy cồn khoảng 5 - 10 giây), sau đó nhanh chóng rửa lại bằng nước.
+ Phủ lên tiêu bản dung dịch fuchsin trong 1 phút, sau đó rửa nhẹ bằng nước. Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, tiến hành quan sát hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (X100).
Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi.
Làm tiêu bản giọt treo:
Sử dụng phiến kính có một mặt cầu lõm và lamen.
Dùng que cấy vòng lấy một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid Thioglycolate đặt vào giữa lamen.
Lấy vaselin chấm vào 4 góc lamen và lật ngược nhanh lamen xuống để giọt dịch treo dưới lamen.
Đặt nhẹ nhàng lamen xuống vòm lõm của phiến kính sao cho giọt treo không chạm xuống đáy hoặc thành vòm lõm.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính dầu (X100).
2.4.5. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
Dùng pipet 1000 µl, hút 1000 µl môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf. Tiến hành ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 4 phút. Bỏ phần nước trong, giữ lại phần cặn. Hút 500 µl glycol nguyên chất hòa vào phần cặn, sau đó bổ sung thêm 500 µl môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Fluid Thioglycolate). Vortex cho hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ lạnh ở nhiệt độ - 80oC.
2.4.6. Giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA của các chủng C.
perfringens đã phân lập theo phương pháp giám định đặc tính sinh vật hóa học đã nêu ở phần trên.
Các bước tách chiết DNA:
- Bước 1: Hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluid Thioglycolate) cho vào ống eppendort. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn.
- Bước 2: Thêm 200 µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn, rồi tiến hành đồng nhất mẫu. Đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông của tủ lạnh (4 - 8oC) trong thời gian 5 phút.
- Bước 3: Ly tâm ở 4oC, tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 4 phút. Thu dịch nổi có chứa DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR. Sau đó DNA được bảo quản ở - 20oC.
Nhân đoạn gene 16S RNA của vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng DNA tách từ các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập để làm DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu (16S - F và 16S - R với kích thước sản phẩm 658 bp) do Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung cung cấp và chu trình nhiệt đã được cài đặt để nhân gene 16S RNA của các chủng C. perfringens đã phân lập thông qua phản ứng PCR (Karl Mullis và cộng sự, 1985).
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 94°C 94°C 10 phút 62°C 72°C 72°C 4°C 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút ∞ 30 chu kỳ
Bảng 2.1. Các thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 PCR buffer 2
2 dNTP 1
3 MgCl2 1
4 Taq DNA polymerase 0,1
5 16S - F: 5’ CGAGCGATGAAGTTTCCTT 3’ 16S - R: 3’ ACAGTCCAGAGTCGCCTT 5’
0,25 0,25
6 DNA khuôn mẫu 3
7 Free water 17,4
Tổng 25
Bảng 2.2. Nội dung các bước tiến hành chạy PCR
Các bước
Nội dung các bước
Cài đặt chương trình cho máy luân nhiệt
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút)
1 1 94 10 94 1 62 1 2 30 72 1 1 3 1 72 10
2 Chuẩn bị mẫu dung dịch chứa đủ các thành phần đã nêu trên và DNA đích trong các ống eppendort.
3 Chạy máy luân nhiệt.
Cho các ống eppendort vào máy luân nhiệt.
Bật máy hoạt độngcho đến khi kết thúc cho chữ END.
(PCR với 30 chu kỳ khuếch đại, sau đó sản phẩm sẽ được phát hiện bằng điện di).
Phát hiện sản phẩm:
Sản phẩm của phản ứng PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ 0,8 - 2%.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị thạch: Cân 1,5 gam agarose cho vào 100 ml đệm TBE (Tris Boric EDTA) rồi cho hỗn hợp đó vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng trong 5 phút để làm nóng chảy agarose.
Đổ gel: Để nguội gel đến khoảng 50oC, bổ sung 6 µl Ethidium bromide rồi lắc đều. Sau đó, đổ gel vào bể điện di đã cài sẵn lược. Để gel đông lại (khoảng 30 - 40 phút), rút răng lược ra sẽ được một dãy các giếng.
Điện di: Hút 8 µl maker cho vào giếng 1; 8 µl mẫu đối chứng dương (mẫu đối chứng dương do Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung cung cấp) cho vào giếng 2; 8 µl mẫu đối chứng âm (thay DNA mẫu bằng nước siêu sạch) cho vào giếng 3; các giếng tiếp theo tra các mẫu đã chạy PCR vào. Tiến hành điện di bằng dòng điện một chiều. Thời gian điện di phụ thuộc vào độ lớn DNA, nồng độ agarose và hiệu điện thế (thông thường từ 50 - 150 V, tùy thiết bị). Ở đây, chúng tôi tiến hành chạy với hiệu điện thế 110 V và cường độ dòng điện 80 mA.
Đọc kết quả: Dựa vào phổ điện di sản phẩm PCR trên máy đọc gel kết nối với máy tính dưới tia tử ngoại (UV) tiến hành đọc kết quả: Nếu trên phổ điện di xuất hiện những băng có kích thước khoảng 658 bp,trùng với kích thước sản phẩm cặp mồi của đoạn gene 16S RNA do nhà thiết kế mồi đưa ra. Điều này chứng tỏ phản ứng PCR đã nhân khá đặc hiệu đoạn gene 16S RNA có kích thước mong muốn. Dựa vào đó, chúng ta khẳng định một số chủng vi khuẩn đã phân lập được là
C. perfringenes.
2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999). PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999).
Dựa vào việc xác định gene mã hóa các độc tố chính của các vi khuẩn đã phân lập được bằng việc sử dụng phản ứng Multiplex PCR để xác định type vi khuẩn (Songer J.G. và cộng sự, 1999).
Phản ứng Multiplex PCR là một dạng cải tiến của phản ứng PCR thông thường. Đây là phản ứng PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích đặc hiệu từ nhiều vi sinh vật mong muốn được phát hiện đồng thời. Ở đó hai hoặc hơn hai đoạn gene được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng.
Như vậy, các bước tiến hành phản ứng Multiplex PCR tương tự phản ứng PCR đã thực hiện ở 2.4.6, chỉ khác ở chỗ Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho từng loại gene mã hóa một số độc tố của C. perfringens. Và chu trình nhiệt cũng có một vài thay đổi.
Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng Multiplex PCR Bảng 2.3. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR
Gene Mồi Trình tự mồi Kích thước sản
phẩm PCR (bp) cpa - F 5’ GCTAATGTTACTGCCGTTGA 3’ Cpa cpa - R 3’ CCTCTGATACATCGTGTAAG 5’ 324 cpb - F 5’ GCGAATATGCTGAATCATCTA 3’ Cpb cpb - R 3’ GCAGGAACATTAGTATATCTTC 5’ 196 etx - F 5’ GCGGTGATATCCATCTATTC 3’ Etx etx - R 3’ CCACTTACTTGTCCTACTAAC 5’ 655 iA - F 5’ ACTACTCTCAGACAAGACAG 3’ Ia iA - R 3’ CTTTCCTTCTATTACTATACG 5’ 446 94°C 94°C 5 phút 55°C 72°C 72°C 4°C 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút ∞ 30 chu kỳ
Bảng 2.4. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 PCR buffer 10X 2,5 2 MgC12 25 mM 1,5 3 dNTPs 2,5 mM 2,0 4 Q solution 5X 1,0 5 Cpa-F 10 pmol 0,25 6 Cpa-R 10 pmol 0,25 7 Cpb-F 10 pmol 0,25 8 Cpb-R 10 pmol 0,25 9 iA-F 10 pmol 0,25 10 iA-R 10 pmol 0,25 11 Cpe-F 10 pmol 0,25 12 Cpe –R 10 pmol 0,25
14 Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,4
15 DNase - free water 11,6
16 DNA khuôn mẫu 3
Tổng 25
2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học:
Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính =
Số mẫu kiểm tra
x 100
Sử dụng hàm chitest xử lý trên phần mềm Excel với mức ý nghĩa α = 0,05 (giá trị P < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens
Để xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens, chúng tôi tiến hành lấy 60 mẫu phân tại hai trại chăn nuôi gà ở cầu Dứa (35 mẫu khỏe mạnh; 25 mẫu nghi bệnh) và 25 mẫu manh tràng tại một cơ sở giết mổ gà ở chợ Vĩnh Hải.
Phân tích 85 mẫu thu được theo phương pháp phân lập vi khuẩn C.
perfringens của Quinn và cộng sự (1994). Qua đó, xác định được mức độ nhiễm vi khuẩn C. perfringens và đánh giá vai trò của bệnh viêm ruột hoại tử trên đàn gà nuôi tại địa bàn thành phố Nha Trang - Khánh Hòa. Kết quả phân lập vi khuẩn C.
perfringens được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân và mẫu manh tràng của gà
Mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỉ lệ dương tính (%) Gà khỏe mạnh 35 3 8,6 Gà nghi bệnh 25 11 44 Phân Tổng mẫu 60 14 23,3 Manh tràng 25 8 32 Tổng chung 85 22 25,9
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, trong 85 mẫu phân và manh tràng mà chúng tôi thu được có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens, chiếm tỷ lệ 25,9%. Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Saad Gharaibeh và cộng sự (2010), khi nhóm tác giả đã nghiên cứu phân lập được 67 chủng vi khuẩn C. perfringens từ 155 mẫu phân gà đem phân tích (chiếm 43,2%). Trong 22 mẫu