phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA của các chủng C.
perfringens đã phân lập theo phương pháp giám định đặc tính sinh vật hóa học đã nêu ở phần trên.
Các bước tách chiết DNA:
- Bước 1: Hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluid Thioglycolate) cho vào ống eppendort. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn.
- Bước 2: Thêm 200 µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn, rồi tiến hành đồng nhất mẫu. Đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông của tủ lạnh (4 - 8oC) trong thời gian 5 phút.
- Bước 3: Ly tâm ở 4oC, tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 4 phút. Thu dịch nổi có chứa DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR. Sau đó DNA được bảo quản ở - 20oC.
Nhân đoạn gene 16S RNA của vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng DNA tách từ các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập để làm DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu (16S - F và 16S - R với kích thước sản phẩm 658 bp) do Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung cung cấp và chu trình nhiệt đã được cài đặt để nhân gene 16S RNA của các chủng C. perfringens đã phân lập thông qua phản ứng PCR (Karl Mullis và cộng sự, 1985).
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 94°C 94°C 10 phút 62°C 72°C 72°C 4°C 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút ∞ 30 chu kỳ
Bảng 2.1. Các thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 PCR buffer 2
2 dNTP 1
3 MgCl2 1
4 Taq DNA polymerase 0,1
5 16S - F: 5’ CGAGCGATGAAGTTTCCTT 3’ 16S - R: 3’ ACAGTCCAGAGTCGCCTT 5’
0,25 0,25
6 DNA khuôn mẫu 3
7 Free water 17,4
Tổng 25
Bảng 2.2. Nội dung các bước tiến hành chạy PCR
Các bước
Nội dung các bước
Cài đặt chương trình cho máy luân nhiệt
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút)
1 1 94 10 94 1 62 1 2 30 72 1 1 3 1 72 10
2 Chuẩn bị mẫu dung dịch chứa đủ các thành phần đã nêu trên và DNA đích trong các ống eppendort.
3 Chạy máy luân nhiệt.
Cho các ống eppendort vào máy luân nhiệt.
Bật máy hoạt độngcho đến khi kết thúc cho chữ END.
(PCR với 30 chu kỳ khuếch đại, sau đó sản phẩm sẽ được phát hiện bằng điện di).
Phát hiện sản phẩm:
Sản phẩm của phản ứng PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ 0,8 - 2%.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị thạch: Cân 1,5 gam agarose cho vào 100 ml đệm TBE (Tris Boric EDTA) rồi cho hỗn hợp đó vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng trong 5 phút để làm nóng chảy agarose.
Đổ gel: Để nguội gel đến khoảng 50oC, bổ sung 6 µl Ethidium bromide rồi lắc đều. Sau đó, đổ gel vào bể điện di đã cài sẵn lược. Để gel đông lại (khoảng 30 - 40 phút), rút răng lược ra sẽ được một dãy các giếng.
Điện di: Hút 8 µl maker cho vào giếng 1; 8 µl mẫu đối chứng dương (mẫu đối chứng dương do Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung cung cấp) cho vào giếng 2; 8 µl mẫu đối chứng âm (thay DNA mẫu bằng nước siêu sạch) cho vào giếng 3; các giếng tiếp theo tra các mẫu đã chạy PCR vào. Tiến hành điện di bằng dòng điện một chiều. Thời gian điện di phụ thuộc vào độ lớn DNA, nồng độ agarose và hiệu điện thế (thông thường từ 50 - 150 V, tùy thiết bị). Ở đây, chúng tôi tiến hành chạy với hiệu điện thế 110 V và cường độ dòng điện 80 mA.
Đọc kết quả: Dựa vào phổ điện di sản phẩm PCR trên máy đọc gel kết nối với máy tính dưới tia tử ngoại (UV) tiến hành đọc kết quả: Nếu trên phổ điện di xuất hiện những băng có kích thước khoảng 658 bp,trùng với kích thước sản phẩm cặp mồi của đoạn gene 16S RNA do nhà thiết kế mồi đưa ra. Điều này chứng tỏ phản ứng PCR đã nhân khá đặc hiệu đoạn gene 16S RNA có kích thước mong muốn. Dựa vào đó, chúng ta khẳng định một số chủng vi khuẩn đã phân lập được là
C. perfringenes.