Điện di trên gel agarose

2.2.4.1. Nguyên tắc

Trong thạch agarose pha và nhúng chìm trong đệm TBE 0,5X, sản phẩm PCR là các DNA sợi đôi nhờ mang điện tích âm sẽ bị di chuyển về phía cực dương và sự di chuyển này sẽ xa hay gần khởi điểm là tùy thuộc vào kích thước của sản phẩm PCR dài hay ngắn. sau khi điện di, các DNA kích thước giống hệt nhau sẽ tập trung thành lại thành vạch, gọi là băng DNA, nhìn thấy được nhờ các DNA sợi đôi bị nhuộm bởi ethidium bromide (ethidium bromide gắn kết với DNA bằng cách xen giữa các nucleotide) thành vạch phát huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím của hộp đèn UV. Dựa vào các băng kích thước của thang DNA mà kích thước của sản phẩm PCR có thể tính được hay ước lượng được.

Gel agarose được dùng để phân tích những đoạn có kích thước 0,5-20 kb, giúp phân tích kết quả PCR dựa trên kích thước sản phẩm khuếch đại được.

2.2.4.2. Phương pháp tiến hành

Pha dung dịch TBE 0,5X bằng cách cho 50ml TBE 10X vào một chai đã chứa sẵn 950ml nước cất, lắc đều.

Pha gel agarose 1,5% bằng cách trộn 0,6g agarose trong 40ml TBE 0,5X. Đun cho tan agarose hoàn toàn, để gel nguội xuống khoảng 50oC, cho vào gel 2µl ethidium bromide 10mg/ml, trộn hòa tan đều ethidium bromide vào trong gel, tránh làm gel có bọt khí khi trộn. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn. Sau đó đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị. Chờ đến khi gel đông đặc, gỡ bỏ lược, lấy bản gel ra khỏi khuôn. Đặt bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X cho ngập bản gel.

Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 2µl đệm tải (loading dye buffer) và 6-8µl mẫu thử đã chạy xong chương trình PCR, trộn đều. Tải các sản phẩm PCR đã trộn với đệm tải vào các giếng trên bản gel agarose đã nhúng chìm trong đệm TBE 0,5X ở máng điện di. Phải luôn luôn có một giếng giành cho thang DNA. Chạy điện di trong 20-30 phút ở dòng điện 90V. Sau khi chạy điện di xong (khi thấy vạch màu xanh cách xa giếng khoảng 2-2,5cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên hộp UV. Xem các băng DNA dưới tia sáng của đèn UV. So với thang DNA để biết kích thước của sản phẩm PCR. Chụp hình giữ kết quả.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết

3.1.1.1. Các thông số của mồi

Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc thứ cấp… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (http://www.idtdna.com). Kết quả trình bày trong bảng :

Bảng 3.1: Một số đặc tính của cặp mồi LSNV 20AF/20AR

Tên mồi Chiề u dài Thành phần GC(%) Nhiệt độ biến tínhTm(oC) Self- dimer ΔG (Kcal/mol) Hetero- dimer ΔG (Kcal/mol) 20AF 20AR 20 20 60 65 65.7 66.6 -3.61 -9.75 -6.68 -6.68 Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng:

Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18 – 25bp), cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.

Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xuôi và mồi ngược không lớn, dao động trong khoảng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.

Về thành phần GC: tỷ lệ GC nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi (40 – 65%).

Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:

Các mồi đ ều có sự hình thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do G lớn hơn -9 kcal/mol (thường thì các cấu trúc thứ cấp có G lớn hơn -9 kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) như kết quả trên hình 3.2 và hình 3.3.

Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR a. LSNV20AF

b. LSNV 20AR

Hình 3.3: Một số cấu trúc self- dimer của mồi

Về cấu trúc hetero-dimer: qua khảo sát cũng nhận thấy mồi xuôi và mồi ngược có sự hình thành cấu trúc hetero-dimer với nhau, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc này đều có G lớn hơn – 9 kcal/mol (Hình 3.4).

3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi

Song song với việc kiểm tra các đặc tính của mồi, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc cũng như độ đặc hiệu của mồi trên lý thuyết.

Để khảo sát các yếu tố này, chúng tôi tiến hành BLAST từng trình tự mồi lên ngân hàng cơ sở dữ liệu Genebank của NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với trình tự này, sắp gióng các mồi với những trình tự chuẩn bằng phần mềm ClustalX.

Sau khi khảo sát, chúng tôi nhận thấy, các mồi bắt cặp 100% với các trình tự LSNV với tỷ lệ cao nhất (hình 3.5).

a. LSNV 20AF

b. LSNV 20AR

Hơn thế nữa, vị trí bắt cặp của các mồi có độ bảo tồn cao với các trình tự LSNV gây nhiễm.

>20AF TTGCCTTCTCCCGAGTGGTC

>20AR CCGGCTGAGGTAGCTGCTTG->reverse complement:

CAAGCAGCTACCTCAGCCGG

>DQ127905.1| Laem Singh virus putative RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) mRNA, partial cds CGTTGCCTTCTCCCGAGTGGTCAGGTTTACGCGCAAGAGTTCTCAGGCTTCATGAAGTCA GGCATTGTGAATACTATCTCCACCAATTCTCATGCCCAGATCATGCTGCATATGCTTGCTTG CAAGCGCTCGGGTGAGCCCGTGACTCCTATATTAGCCTGCGGTGATGACACTATTCAAGCA GCTACCTCAGCCGGTTATATTGAAGAGCTGGCGAAGGCAGGGTGCATTGTTAAGAGTGTCG ATCGCAAGCTAGAGTTTATGGGTTTTAACTTTGAGGGCGCCATGCAACCAATCTACACCAT GAAACACATCGCATCTTTTACTTATAAGAGTGAGGAGCTTCATGGTGAGATTTTAGATAGC ATGTGCAGAATGTACGCTCACCACCCCTGGTTTGACTGTTGGAAGATGTTAGCAGGCTCTT TGGGCCATAATATGAAGTCTAGAGCCTGGTATCAGTTCTTCCTTGATAGTACAGCCAATAT CAGGATCACGAAGTCCATTTAGATAGAGGATGACGTGAGCTGGCTATGTTTTCTACCTTTC CTGTAACGTGGCGGTTCTGAGGGGGCGTGTGCCAATACGTTTCTGGGGCAAAAAAAAAAA AAAAAA

Hình 3.6: Kết quả sắp gióng các mồi với trình tự chuẩn DQ127905.1

Kết quả trên cho thấy cặp mồi LSNV cho kết quả bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu. Từ kết quả trên chúng tôi có thể kết luận, trên lý thuyết LSNV 20AF/AR có thể bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu và có độ đặc hiệu cao.

3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR phản ứng PCR

3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế

Để kiểm tra hoạt động của mồi sau khi tổng hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng RT- PCR theo quy trình RT- PCR một bước của Sritunyalucksana (2006) và RT- PCR hai bước. Sau đó điện di trên gel agarose 1.5% với chứng dương cung cấp bởi RIA2 (hình 3.7).

Giếng M: Thang chuẩn DNA 100bp Giếng 1 : Mẫu âm tính

Hình 3.7: Kết quả áp dụng quy trình RT-PCR trên mẫu dương tính

Qua kết quả trên cho thấy:

- Chứng âm không xuất hiện băng DNA quan tâm, do vậy có thể kết luận quá trình tách chiết và đặt phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm.

- Mẫu chứng dương LSNV cho vạch sản phẩm sáng rõ ở vị trí khoảng 200bp so với thang chuẩn DNA 100bp.

Như vậy trên thực nghiệm, cặp mồi 20AF/AR có khả năng bắt cặp tốt với trình tự RNA của virus LSNV và nhân bản tạo thành sản phẩm có kích thước khoảng 200bp, đúng với kết quả dự kiến ban đầu. Quy trình RT-PCR này cho kết quả trên gel agarose dễ dàng, sản phẩm khuếch đại rõ và không ghi nhận thấy bất kì băng sản phẩm phụ nào ngoài sản phẩm đặc hiệu của virus LSNV.

3.2.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu

Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Tm (melting temperature) là nhiệt độ biến tính mạch. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khuôn mẫu. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao thì việc

1000bp

200bp 500bp

lựa chọn nhiệt độ bắt cặp của mồi một cách phù hợp là công việc quan trọng. Nhiệt độ bắt cặp quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR. Nhiệt độ bắt cặp quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp mồi sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ bắt cặp quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi vào khuôn mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao.

Một cách cụ thể, cần chọn Ta sao cho mồi bắt cặp bổ sung hoàn toàn với mạch khuôn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn. Do vậy, cần tiến hành thử nghiệm các phản ứng PCR ở những nhiệt độ Ta gần Tm để tìm Ta thích hợp nhất sao cho sản phẩm PCR thu được là duy nhất.

Để khảo sát nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho quy trình, chúng tôi thực hiện phản ứng (với chứng dương tách chiết từ mẫu tôm đã biết trước có bệnh) và thiết lập 1 gradient nhiệt độ cho mồi LSNV 20AF/AR từ 52oC đến 62oC nhằm khảo sát nhiệt độ bắt cặp tốt nhất của mồi vào trình tự gen đích trên thực tế. Sau các lần lặp lại thí nghiệm trên. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi được thể hiện ở hình 3.8.

Hình 3.8 : Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tối ưu hóa nhệt độ lai

1000bp

500bp

Giếng M: thang chuẩn DNA

Giếng 1: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 52oC Giếng 2: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 54oC Giếng 3: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 56oC Giếng 4: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 58oC Giếng 5: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 60oC Giếng 6: Mẫu chứng dương khảo sát ở nhiệt độ lai 62oC

Kết quả điện di trên cho thấy ở các nhiệt độ khảo sát trên đều cho phép phát hiện LSNV, trong đó kết quả thí nghiệm ở 60oC cho thấy băng sản phẩm sáng nhất, các nhiệt độ 52oC, 54oC, 56oC, 58oC, 62oC cho kết quả dương tính nhưng vệt băng sản phẩm tương đối mờ, chứng tỏ cặp mồi 20AF và 20AR tuy có bắt cặp trên khuôn mẫu nhưng hiệu suất bắt cặp không cao. Chính vì vậy, lượng khuôn đích chỉ có thể khuếch đại lên với số lượng không nhiều và do đó cho kết quả điện di tương đối mờ. Từ những phân tích trên, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi 20AF và 20AR là 60oC để xây dựng chương trình chuẩn cho phản ứng RT- PCR phát hiện virus laem singh gây bệnh trên tôm sú.

3.2.3. Xác định tính đặc hiệu

Trong phản ứng RT-PCR, mồi được xem là một nhân tố quan trọng quyết định phản ứng có diễn ra thành công hay không vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi RNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm RT-PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm quy trình càng đặc hiệu. Do đó, để tối ưu hóa phản ứng RT- PCR, chúng tôi tiến hành xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi 20AF và 20AR bằng cách tiến hành sử dụng cặp mồi với các RNA virus khác gây bệnh trên tôm sú.

Tôm sú là vật chủ của nhiều tác nhân gây bệnh. Một số virus RNA đã được xác định là tác nhân nguy hiểm thường gặp trên tôm sú nuôi tại Việt Nam là Yellow Head virus(YHV), Gill associated virus (GAV). Chúng tôi sử dụng mẫu dương tính chứa RNA từ hai loại virus YHV, GAV để kiểm tra tính đặc hiệu của phương pháp RT- PCR trong nghiên cứu này (hình 3.8).

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc

hiệu của quy trình RT-PCR

Giếng M: thang chuẩn DNA 100bp Giếng 1: Đối chứng dương

Giếng 2: Mẫu dương tính LSNV Giếng 3: Đối chứng âm

Giếng 4: Mẫu chứng dương bệnh YHV Giếng 5: Mẫu chứng dương bệnh GAV

Kết quả phân tích sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho thấy băng sản phẩm đặc trưng cho LSNV, các mẫu còn lại không có tín hiệu. Chứng tỏ cặp mồi 20AF/AR chỉ bắt cặp với RNA của LSNV mà không bắt cặp với RNA của virus gây bệnh khác. Như vậy, sau 3 lần thử độ đặc hiệu của quy trình đều cho kết quả giống nhau, chỉ duy nhất mẫu chứng dương mới xuất hiện băng tín hiệu 197bp đặc trưng cho LSNV. Trong phạm vi nghiên cứu này, quy trình cho phép phát hiện đặc hiệu với LSNV.

3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp

Kỹ thuật RT-PCR đã được áp dụng để phát hiện LSNV ở một vài nơi trên thế giới (Prakasha và cộng sự, 2007; Sittidilokratna và cộng sự, 2009b) Tuy nhiên giới hạn phát hiện của quy trình này chỉ mới được báo cáo tại Việt Nam (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011). Giới hạn phát hiện của quy trình RT-PCR là một yêu cầu

1000bp

500bp

quan trọng để đánh giá chất lượng của một quy trình PCR. Trong kỹ thuật RT- PCR sự khuếch đại RNA phụ thuộc nhiều vào khả năng hoạt động của hai enzyme RNA Reverse transcriptase và DNA polymerase. Vì thế, để xác định độ nhạy của phương pháp RT- PCR phát hiện virút LSNV trong nghiên cứu này chúng tôi đã pha loãng trình tự đích là các sợi RNA nhân tạo của virút LSNV từ các chứng dương LSNV cung cấp bởi RIA2 ở các nồng độ khác nhau (từ 10o đến 107 bản sao/2ul) nhằm tạo các mức độ nhiễm khác nhau của LSNV trên thực tế để kiểm tra giới hạn phát hiện của phương pháp chẩn đoán. Ở mỗi nồng độ, tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên, từ đó xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.

Hình 3.9: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR hai bước

Giếng 1: số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 101 bản sao/ phản ứng Giếng 2: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 102 bản sao/ phản ứng Giếng 3: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 103 bản sao/ phản ứng Giếng 4: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 104 bản sao/ phản ứng Giếng 5: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 105 bản sao/ phản ứng Giếng 6: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là106 bản sao/ phản ứng Giếng 7: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 107 bản sao/ phản ứng

Giếng M: Thang chuẩn DNA 100bp

Hình 3.10: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR một bước

Với kết quả ở hình 3.9 và hình 3.10 trên cho thấy: ở nồng độ mẫu là 107-102

xuất hiện băng đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại của LSNV (197bp) với độ sáng giảm dần, đến nồng độ 102 thì vạch sáng mờ đi nhiều và đến các nồng độ 101 thì không còn thấy xuất hiện băng nữa. Vạch sáng ở nồng độ 102 ởquy trình RT-PCR một bước cho băng điện di sáng hơn, các kết quả điện di không tạo thành các khuếch đại ‘ký sinh’. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đây (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011).

1000bp 500bp 200bp

Kết quả trên cho thấy quy trình RT- PCR này có thể phát hiện 100-1000 bản sao virus/ phản ứng xét nghiệm. Ngoài ra việc áp dụng quy trình RT- PCR một bước cho phép rút ngắn thời gian, thao tác và giảm thiểu khả năng tạp nhiễm so với phương pháp RT-PCR hai bước.

3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH KHÁNH HÒA VỰC TỈNH KHÁNH HÒA

Để xác định tôm sú ở các trại nuôi tôm Khánh Hòa có bị nhiễm LSNV hay không, chúng tôi ứng dụng quy trình trên 80 mẫu tôm sú thu nhận hai đợt, vào mùa mưa và vào mùa khô. Kết quả phân tích cho cho thấy có 13/80 mẫu tôm sú nuôi

Thiết lập điều kiện phản ứng

Xác định tính đặc hiệu