a. DNA mạch khuôn
Theo Khuất Hữu Thanh (2003), khuôn ADN có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên khuôn DNA thật tinh sạch, khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của ADN khuôn. Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao, nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản
ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng.
b. Mồi (primer)
Mồi là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR. Để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao thì mồi sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại và phải tuân thủ theo những nguyên tắc về sự bắt cặp giữa các mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính, nồng độ mồi…
Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5oC và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72oC. Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3. Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn PCR không thành công. Tỉ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững. Tuy nhiên trình tự GC không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi. Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại.Trình tự DNA cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn 1kb. Sợi ADN được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do. Do đó đầu 5’ của mồi có thể được gắn thêm đoạn nucleotide điều khiển (promoter). Thể tích mồi khoảng 0,1mM đến 0,5mM. Thể tích mồi thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260nm (Võ Thị Thương Lan, 2006).
c. Enzyme
DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các đặc tính của DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau.
Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1-2,5 đơn vị (u) cho 100 µl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25µl. Nếu nồng độ Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme
để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn...
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn2+ ; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg2+, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)
d. Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphostphate)
Nồng độ các dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) thường được sử dụng là 20- 200 µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh’’. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Mất cân bằng trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Khuất Hữu Thanh, 2003).
e. Nồng độ MgCl2
Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, là cofactor cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ hoạt động kém và hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao làm tăng hiện tượng bắt cặp giả và cho ra những sản phẩm không đặc hiệu. Chính vì vậy phải có nồng độ tối ưu cho từng phản ứng. Thông thường, Mg2+ được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 – 4 mM (Nguyễn Thị Xô và Nguyễn Thị Loan, 2005).
f. Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR.
Ngoài các thành phần trên chu kỳ phản ứng cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR. Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), số lượng chu kỳ PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đọan đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, do sự
xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng và do các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
1.3.5. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase linked to Polymerase Chain Reaction)
Cùng với kĩ thuật PCR, RT- PCR cũng đã trở thành một kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh y, RT-PCR đã tạo ra nhiều cơ hội trong chẩn đoán, cho phép phát hiện các virus RNA.
Nguyên tắc của phương pháp:
Phương pháp này cơ bản dựa vào phản ứng khuếch đại phân tử (PCR) nhưng có sử dụng enzyme phiên mã ngược, với nguyên liệu ban đầu là phân tử mRNA. Phương pháp được minh họa qua hình 1.11. Do Taq polymerase không hoạt động trên mRNA nên người ta dùng phối hợp enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) với taq polymerase gọi là RT-PCR. Trước hết RNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi sử dụng cho giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau, có thể là đoạn nucleotide oligo T (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), mà cũng có thể là các hexannucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên mRNA. Ngoài ra còn có RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA. Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq Polymerase. Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng thấp (Hồ Huỳnh Thùy Dương , 2003).
Hình 1.11: Sơ đồ minh họa một quy trình RT- PCR.(Nguồn: http://www.gene-