Kỹ thuật RT-PCR đã được áp dụng để phát hiện LSNV ở một vài nơi trên thế giới (Prakasha và cộng sự, 2007; Sittidilokratna và cộng sự, 2009b) Tuy nhiên giới hạn phát hiện của quy trình này chỉ mới được báo cáo tại Việt Nam (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011). Giới hạn phát hiện của quy trình RT-PCR là một yêu cầu
1000bp
500bp
quan trọng để đánh giá chất lượng của một quy trình PCR. Trong kỹ thuật RT- PCR sự khuếch đại RNA phụ thuộc nhiều vào khả năng hoạt động của hai enzyme RNA Reverse transcriptase và DNA polymerase. Vì thế, để xác định độ nhạy của phương pháp RT- PCR phát hiện virút LSNV trong nghiên cứu này chúng tôi đã pha loãng trình tự đích là các sợi RNA nhân tạo của virút LSNV từ các chứng dương LSNV cung cấp bởi RIA2 ở các nồng độ khác nhau (từ 10o đến 107 bản sao/2ul) nhằm tạo các mức độ nhiễm khác nhau của LSNV trên thực tế để kiểm tra giới hạn phát hiện của phương pháp chẩn đoán. Ở mỗi nồng độ, tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên, từ đó xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.
Hình 3.9: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR hai bước
Giếng 1: số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 101 bản sao/ phản ứng Giếng 2: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 102 bản sao/ phản ứng Giếng 3: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 103 bản sao/ phản ứng Giếng 4: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 104 bản sao/ phản ứng Giếng 5: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 105 bản sao/ phản ứng Giếng 6: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là106 bản sao/ phản ứng Giếng 7: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 107 bản sao/ phản ứng
Giếng M: Thang chuẩn DNA 100bp
Hình 3.10: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR một bước
Giếng 1: số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 101 bản sao/ phản ứng Giếng 2: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 102 bản sao/ phản ứng Giếng 3: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 103 bản sao/ phản ứng Giếng 4: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 104 bản sao/ phản ứng Giếng 5: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là 105 bản sao/ phản ứng Giếng 6: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là106 bản sao/ phản ứng Giếng 7: Số lượng bản sao RNA của virus LSNV là107 bản sao/ phản ứng Giếng M: Thang chuẩn DNA 100bp
Với kết quả ở hình 3.9 và hình 3.10 trên cho thấy: ở nồng độ mẫu là 107-102
xuất hiện băng đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại của LSNV (197bp) với độ sáng giảm dần, đến nồng độ 102 thì vạch sáng mờ đi nhiều và đến các nồng độ 101 thì không còn thấy xuất hiện băng nữa. Vạch sáng ở nồng độ 102 ởquy trình RT-PCR một bước cho băng điện di sáng hơn, các kết quả điện di không tạo thành các khuếch đại ‘ký sinh’. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đây (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011).
1000bp 500bp 200bp
Kết quả trên cho thấy quy trình RT- PCR này có thể phát hiện 100-1000 bản sao virus/ phản ứng xét nghiệm. Ngoài ra việc áp dụng quy trình RT- PCR một bước cho phép rút ngắn thời gian, thao tác và giảm thiểu khả năng tạp nhiễm so với phương pháp RT-PCR hai bước.