Trong phản ứng RT-PCR, mồi được xem là một nhân tố quan trọng quyết định phản ứng có diễn ra thành công hay không vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi RNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm RT-PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm quy trình càng đặc hiệu. Do đó, để tối ưu hóa phản ứng RT- PCR, chúng tôi tiến hành xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi 20AF và 20AR bằng cách tiến hành sử dụng cặp mồi với các RNA virus khác gây bệnh trên tôm sú.
Tôm sú là vật chủ của nhiều tác nhân gây bệnh. Một số virus RNA đã được xác định là tác nhân nguy hiểm thường gặp trên tôm sú nuôi tại Việt Nam là Yellow Head virus(YHV), Gill associated virus (GAV). Chúng tôi sử dụng mẫu dương tính chứa RNA từ hai loại virus YHV, GAV để kiểm tra tính đặc hiệu của phương pháp RT- PCR trong nghiên cứu này (hình 3.8).
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc
hiệu của quy trình RT-PCR
Giếng M: thang chuẩn DNA 100bp Giếng 1: Đối chứng dương
Giếng 2: Mẫu dương tính LSNV Giếng 3: Đối chứng âm
Giếng 4: Mẫu chứng dương bệnh YHV Giếng 5: Mẫu chứng dương bệnh GAV
Kết quả phân tích sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho thấy băng sản phẩm đặc trưng cho LSNV, các mẫu còn lại không có tín hiệu. Chứng tỏ cặp mồi 20AF/AR chỉ bắt cặp với RNA của LSNV mà không bắt cặp với RNA của virus gây bệnh khác. Như vậy, sau 3 lần thử độ đặc hiệu của quy trình đều cho kết quả giống nhau, chỉ duy nhất mẫu chứng dương mới xuất hiện băng tín hiệu 197bp đặc trưng cho LSNV. Trong phạm vi nghiên cứu này, quy trình cho phép phát hiện đặc hiệu với LSNV.