Kích thước mẫu theo độ tuổi có sức đề kháng mầm bệnh là khác nhau. Vì vậy, để xác định tỷ lệ nhiễm LSNV trên tôm sú theo các kích thước, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu tôm giống, tôm có dấu hiệu chậm lớn và tôm bình thường ở tỉnh Khánh Hòa theo hai mùa. Các mẫu sau khi thu thập được đưa về phòng thí nghiệm để tách chiết RNA tổng số và chạy RT-PCR để xác định tỷ lệ nhiễm LSNV. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm trên các mẫu tôm sú thu thập được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo độ tuổi mẫu
Tôm giống Tôm MSGS Tôm bình
thường
Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ Mẫu
dương tính
0/25 0% 11/30 36,67% 2/25 8%
Kết quả nghiên cứu chỉ ra tần suất bắt gặp sự hiện diện của virus LSNV ở khu vực nuôi tỉnh Khánh Hòa là 16,25%. Trong đó không phát hiện có sự hiện diện của LSNV trên tôm giống. Chưa có công bố nào trên thế giới đề cập đến tỷ lệ nhiễm LSNV trên tôm sú giống. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của RIA2 đã phát hiện ra tôm sú giống bị nhiễm LSNV chiếm 1% (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2007). Điều này chứng tỏ tần suất xuất hiện LSNV trên tôm sú giống là rất ít xảy ra ở Khánh Hòa.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra tần suất bắt gặp sự hiện diện của virus LSNV trên tôm sú có dấu hiệu chậm lớn ở khu vực nuôi tỉnh Khánh Hòa là 36,67%. Một nghiên cứu tương tự ở Thái Lan năm đã phát hiện 39/40 mẫu tôm sú có dấu hiệu chậm lớn nhiễm virus LSNV (Sittidilokratna và cộng sự, 2009). Ở Việt Nam, một nghiên cứu các mẫu có dấu hiệu chậm lớn tại tỉnh Sóc Trăng cho thấy có 14/27 mẫu phân tích (chiếm 63%) (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trên các mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn ở khu vực trong tỉnh bị nhiễm LSNV thấp hơn so với mẫu ở Sóc Trăng-Việt Nam và mẫu ở Thái Lan, tuy nhiên tần suất 36,67% nhiễm LSNV trên địa bàn tỉnh là một con số đáng báo động.
Nghiên cứu gần đây nhất giả thuyết rằng virus LSNV là điều kiện cần nhưng chưa phải là điều kiện đủ gây chậm lớn trên tôm sú. Một tác nhân khác cùng hiện diện với LSNV ở các mẫu tôm chậm lớn mới đã được xác định và đặt tên ICE (integrase-containing element) (Panphut và cộng sự, 2011). Theo nghiên cứu này sự hiện diện một mình của virus LSNV không gây ra hiện tượng chậm lớn khi thực nghiệm trong phòng thí nghiệm. Trong khi đó kết quả cảm nhiễm đồng thời virus LSNV và tác nhân ICE cho thấy dấu hiện chậm lớn rõ rệt xuất hiện ở tôm thí nghiệm. Một điều đáng chú ý khác là nhóm nghiên cứu này cũng không phát hiện thấy sự hiện diện một mình của ICE trên các mẫu tôm (Panphut và cộng sự, 2011).
Kết quả phân tích các mẫu tôm sú bình thường trên địa bàn tỉnh bị nhiễm LSNV là 8%. Sự xuất hiện của virus LSNV trên cả tôm có dấu hiệu chậm lớn và tôm phát triển bình thường cũng đã từng được ghi nhận trước đây (Sritunyalucksana
và cộng sự, 2006). Một nghiên cứu ở Ấn Độ cho thấy tỉ lệ nhiễm virus LSNV trên các ao nuôi công nghiệp khi được phân tích ngẫu nhiên là 3/56 ao nuôi (5,4%) (Prakasha và cộng sự, 2007).Trong một nghiên cứu khác trên mẫu thu năm 2007 ở Andhra Prades Ấn Độ đã ghi nhận 56% trong số 81 mẫu nghiên cứu được xác định nhiễm virus LSNV trong khi các mẫu này không có dấu hiệu chậm lớn (Sittidilokratna và cộng sự, 2009). Một nghiên cứu các mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long có tỷ lệ nhiễm 10,6% (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự hiện diện rõ rệt của virus LSNV trong hệ thống tôm nuôi hiện nay ở khu vực tỉnh Khánh Hòa. Mặc dù chúng tôi chưa xác định sự hiện diện của tác nhân ICE, tuy nhiên, sự khác biệt tần suất nhiễm virút LSNV ở các mẫu có dấu hiệu chậm lớn (36,67%) so với mẫu tôm thương phẩm thu ngẫu nhiên (8%) cho thấy virus LSNV rất có thể liên quan đến hiện tượng chậm lớn ở tôm nuôi Việt Nam trong thời gian qua.
Do virus LSNV đã được xác định hiện diện trên cả tôm Sú và có khả năng lây nhiễm ở các loài giáp xác quanh khu vực nuôi nên có thể ảnh hưởng đến sự lan truyền đến hệ thống canh tác, mặt khác LSNV liên quan đến bệnh chậm lớn vì vậy nếu kéo dài thời gian nuôi sẽ làm giảm năng suất, gây thiệt hại cho người nuôi vì phải kéo dài thời gian chăm sóc, phát sinh thêm chi phí thức ăn và thuốc men cho tôm. Vì vậy, việc áp dụng phương pháp RT- PCR để giám sát virus LSNV là cần thiết để nâng cao chất lượng tôm sú tại khu vực tỉnh Khánh Hòa.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau: - Đã tách chiết được 80 mẫu tôm sú thu mua ở các trang trại nuôi tôm ở huyện Ninh Hòa, Vạn Ninh, Cam Ranh và thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa.
- Phương pháp RT-PCR được sử dụng trong nghiên cứu này có thể phát hiện lượng virus LSNV trong mẫu tôm bệnh là 100-1000 virus/phản ứng.
- Nên sử dụng phương pháp RT-PCR một bước để cho tránh bị tạp nhiễm và đỡ tốn kém hơn. Quá trình phân tích kết quả trên gel agarose dễ dàng, sản phẩm khuếch đại rõ và không ghi nhận bất kỳ băng sản phẩm phụ nào ngoài sản phẩm đặc hiệu của LSNV.
- Khảo sát nhiệt độ lai tối ưu cho quy trình RT-PCR phát hiện LSNV là 60oC. - Khảo sát sự hiện diện của LSNV trên khu vực nuôi tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa cho thấy tỷ lệ nhiễm LSNV ở các huyện Cam Ranh, Ninh Hòa, Vạn Ninh và thành phố Nha Trang lần lượt là 9,09%, 15,15%, 12,5% và 25%.
Kiến nghị:
- Khảo sát quy trình với số lượng mẫu lớn hơn, tiếp tục thu mẫu từ tháng 6 đến tháng 10, thu từ nhiều nguồn khác nhau để kiểm tra sự hiện diện của bệnh LSNV gây ra trên tôm sú nuôi chính xác hơn.
- Khảo sát độ đặc hiệu của mồi với một số chủng virus khác có trong môi trường ao nuôi cũng như vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản để chắc chắn mồi chỉ đặc hiệu với LSNV.
- Khảo sát quy trình với loài tôm khác do LSNV có sự lây nhiễm ở các loài giáp xác nuôi .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB giáo dục, 2003.
2. Khuất Hữu Thanh, Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, 2003.
3. Nguyễn Thị Xô và Nguyễn Thị Loan ,Cơ sở Di Truyền và Công Nghệ Gen.
NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, 2005.
4. Nguyễn Viết Dũngvà cộng sự, Phát hiện virus Laem singh bằng kỹ thuật RT- PCR trên tôm sú nuôi (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long. Nông Ngiệp và Phát Triển Nông Thôn,, 2011. ISSN 0866-7020, (tháng 12/2011). Trang 86-90.
5. Phạm Văn Ty, Virus học.
6. Võ Thị Thương Lan, Giáo Trình Công Nghệ Sinh học phân tử Tế bào và ứng dụng. NXB giáo dục, 2006.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Chomczynski, P. and N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical
Biochemistry, 1987. 162(1): p. 156-159.
2. Flegel, T.W., Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a historical perspective with emphasis on Thailand. Aquaculture, 2006. 258(1–4): p. 1-33 3. Kanokporn, et al., Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger
shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand. Diseases of Aquatic Organisms, 2004. 60(2): p. 89-96.
4. Lightner, D.V., Handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of cultured penaeid shrimp. World Aquaculture Society, 1996. Baton Rouge, LA.
5. Panphut, W., et al., A novel integrase-containing element may interact with Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp. BMC Veterinary Research, 2011. 7(1): p. 18
6. Prakasha B. K., et al., Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured Penaeus monodon from India. Diseases of Aquatic Organisms, 2007. 77(1): p. 83-86
7. Pratoomthai B., W.K., Flegel W.T., and Withyachumnarnkul B., Infection by Laem-Singh Virus in the fasciculated zone and organ of Bellonci of the eyes of small Penaeus monodon from Monodon slow-growth syndrome pond. Asian- Pacific Aquaculture., 2007. 199.
8. Pratoomthai, B., et al., Retinopathy in stunted black tiger shrimp Penaeus monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV).
Aquaculture, 2008. 284(1–4): p. 53-58.
9. Sathish Kumar T, et al., Natural host-range and experimental transmission of Laem-Singh virus (LSNV). Diseases of Aquatic Organisms, 2011. 96(1): p. 21- 27.
10. Sittidilokratna N, et al., Detection of Laem-Singh virus in cultured Penaeus monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacific region. Diseases of Aquatic Organisms, 2009. 84(3): p. 195-200.
PHỤ LỤC
LSNV 20AR
Bảng P1: Nguồn gốc và kết quả phân tích LSNV trên tôm sú tại phòng thí nghiệm (PTN) Công nghệ Sinh học- bộ môn Công nghệ Sinh học và Môi trường.
Mã PTN
Mùa thu
mẫu Nơi thu Mẫu LSNV
1 Mùa mưa Cam Ranh Tôm giống -
2 Mùa mưa Cam Ranh Tôm giống -
4 Mùa mưa Cam Ranh Tôm MSGS - 5 Mùa mưa Cam Ranh Tôm bình thường -
6 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm giống -
7 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm giống -
8 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm giống -
9 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm giống -
10 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm MSGS ++
11 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm MSGS +
12 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm MSGS -
13 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm MSGS -
14 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm bình thường - 15 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm bình thường - 16 Mùa mưa Ninh Hòa Tôm bình thường -
17 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm giống -
18 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm giống -
19 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm MSGS -
20 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm MSGS -
21 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm MSGS +
22 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm bình thường - 23 Mùa mưa Vạn Ninh Tôm bình thường -
24 Mùa mưa Nha Trang Tôm MSGS -
25 Mùa mưa Nha Trang Tôm MSGS -
26 Mùa mưa Nha Trang Tôm MSGS +
27 Mùa mưa Nha Trang Tôm MSGS ++
28 Mùa mưa Nha Trang Tôm bình thường - 29 Mùa mưa Nha Trang Tôm bình thường - 30 Mùa mưa Nha Trang Tôm bình thường - 31 Mùa mưa Nha Trang Tôm bình thường -
32 Mùa khô Cam Ranh Tôm giống - 33 Mùa khô Cam Ranh Tôm giống - 34 Mùa khô Cam Ranh Tôm giống - 35 Mùa khô Cam Ranh Tôm MSGS ++
36 Mùa khô Cam Ranh Tôm MSGS -
37 Mùa khô Cam Ranh Tôm bình thường - 38 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 39 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 40 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 41 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 42 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 43 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 44 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 45 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 46 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 47 Mùa khô Ninh Hòa Tôm giống - 48 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS
49 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS -
50 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS +
51 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS +
52 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS -
53 Mùa khô Ninh Hòa Tôm MSGS -
54 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường - 55 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường - 56 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường - 57 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường ++ 59 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường - 59 Mùa khô Ninh Hòa Tôm bình thường -
60 Mùa khô Vạn Ninh Tôm giống - 61 Mùa khô Vạn Ninh Tôm giống - 62 Mùa khô Vạn Ninh Tôm giống - 63 Mùa khô Vạn Ninh Tôm giống -
64 Mùa khô Vạn Ninh Tôm MSGS -
65 Mùa khô Vạn Ninh Tôm MSGS -
66 Mùa khô Vạn Ninh Tôm MSGS ++ 67 Mùa khô Vạn Ninh Tôm bình thường - 68 Mùa khô Vạn Ninh Tôm bình thường - 69 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS - 70 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS - 71 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS + 72 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS + 73 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS - 74 Mùa khô Nha Trang Tôm MSGS - 75 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường - 76 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường - 77 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường - 78 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường - 79 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường + 80 Mùa khô Nha Trang Tôm bình thường -
(-) Mẫu âm tính
(+) Mẫu dương tính nhẹ (+) Mẫu dương tính nặng hơn.