2.3.1. Thu và chuẩn bị mẫu
Thu mẫu tôm sú có dấu hiệu chậm lớn, tôm bình thường và tôm giống (post larvae) thu từ các trại tôm còn sống, có thể bảo quản trong đá lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm rồi tiến hành các thao tác bảo quản mẫu trong ethanol 95o hoặc bảo quản lạnh ở -70oC đến -20oC trong tủ đông.
Tùy từng loại mẫu tôm sú mà có phương pháp chuẩn bị thích hợp, lưu ý với mẫu bảo quản trong ethanol 95o, phải làm khô hết ethanol (cả trên bề mặt lẫn trong mô cơ của tôm) trước khi cho vào nước DEPC hoặc dung dịch TE 1X để nghiền; với mẫu bảo quản trong tủ đông phải để rã đông trước khi tiến hành nghiền mẫu:
- Đối với mẫu tôm post, tôm giống: lấy mẫu nguyên 30-50 con còn sống (là tốt nhất) hoặc mẫu đã bảo quản.
- Đối với mẫu tôm nuôi: lấy một phần mang, cầu mắt hoặc cơ quan tạo máu lymphoid của tôm sú (tổng lượng mẫu không quá 1gram).
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số
2.3.2.1. Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên phương pháp của Chomczynskivà Sacchi (1989). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein, màng tế bào…), cụ thể là dùng Guanidine 14M phối hợp với phenol để làm biến tính các protein, kết quả là protein trong mẫu thử sẽ bị vón lại. DNA sẽ tan trong pha phenol, còn RNA thì nằm lại trong pha nước và sẽ được tách ra khỏi pha phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa bởi isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen.
2.3.2.2. Phương pháp tiến hành
Cho mẫu vào một ống cho vào eppendorf, sau đó thêm 200µl DEPC rồi nghiền nhuyễn mẫu. (Lưu ý: mỗi mẫu dùng 1 chày khác nhau để nghiền, trong suốt quá trình xử lý mẫu luôn có 1 đèn cồn và 1 cốc cồn 96o để khử trùng panh kẹp, tránh trường hợp lây nhiễm từ mẫu này sang mẫu khác). Vừa nghiền vừa cho thêm
dần dịch vào cho đến khi tổng thể tích kể cả mẫu là 500µl, ly tâm 10,000 vòng/phút trong 5 phút để lấy 100µl dịch nổi cho vào một tube eppendorf.
Thêm 300µl dung dịch RNAzol vào tube chứa 100µl dịch mẫu thử đã chuẩn bị trên, trộn đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Thêm 80µl chloroform, lắc nhanh và cẩn thận dung dịch bằng cách úp ngữa trong 15 giây. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 15 phút trong máy ly tâm.
Hút cẩn thận 200µl dịch nổi vào một tube sạch khác tránh không hút pha giữa (vì lúc này protein tủa thành một lớp nằm ở pha phenol và tập trung ở mặt phân cách hai pha nên ta chỉ hút dịch nổi là pha nước chứa RNA cần dùng). Thêm 200µl isopropanol, úp ngửa tube 15 giây rồi tiếp tục giữ nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 10 phút ở máy ly tâm. Hút bỏ phần nước nổi, tránh không làm mất cặn RNA đóng một bên đáy tube. Rửa cặn với 700µl ethanol 70o dung ly tâm 8,000 vòng/phút trong 5 phút.
Dùng micropipette hay hút chân không hút bỏ tất cả phần nước nổi. Làm khô cặn ở 55oC trong 10-15 phút. Cho vào cặn khô 50µl DEPC. Giữ ở 55-60oC trong 10 phút. Trước khi phân tích RT-PCR một bước, dung dịch RNA tổng số được biến tính ở 70oC trong 10 phút và làm lạnh nhanh trong đá. Còn nếu chưa thực hiện RT- PCR ngay thì bảo quản dung dịch RNA đã tách chiết này ở -20oC.
2.3.3. Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR
2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng
a. Nguyên tắc
Phương pháp RT-PCR một bước
Phương pháp này thực hiện hai giai đoạn RT và PCR trong cùng một ống phản ứng, nghĩa là sau khi cho tách chiết RNA từ mẫu thử cho vào ống phản ứng, giai đoạn RT sẽ được thực hiện trước và sau đó giai đoạn PCR sẽ đi liền theo sau. Để thực hiện được RT-PCR một bước, trong ống phản ứng phải có đủ các thành phần hóa chất và thuốc thử để chạy RT và PCR, tức là phải có cả enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT và enzyme Taq polymerase chịu nhiệt sử dụng cho PCR. Trong phương pháp RT-PCR một bước, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham
gia vào phản ứng PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT.
Phương pháp RT-PCR hai bước:
Tiến hành thực hiện giai đoạn RT tổng hợp cDNA trong một ống phản ứng, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích cần tìm. Phương pháp này có nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp ống PCR để cho cDNA vào. Do vậy trong phản ứng PCR thường cho thêm dUTP và UNG vào PCR mix để tránh ngoại nhiễm.
b. Phương pháp tiến hành
Phương pháp RT- PCR phát hiện virus LSNV được tối ưu hóa các điều kiện phản ứng thành kỹ thuật RT-PCR một bước với hệ thống hóa chất của hãng Promega và mồi 20AF và 20AR nhận diện và khuếch đại đặc hiệu một vùng trình tự vật liệu di truyền có kích thước 197bp của virus LSNV. Thực hiện phản ứng RT- PCR một bước bằng cách hút 2µl dịch ly trích RNA tổng số của mẫu cần phân tích cho vào 23µl hỗn hợp hóa chất phản ứng RT-PCR bao gồm 35pmol mỗi mồi 20AF và 20AR, đệm Colorless GoTaq® Flexi 1X, 0,2mM dNTPs, 2mM MgCl2, 5U AMV Reverse trancriptase, 1,25U Gotaq® Hotstart Polymerase (Promega, Mỹ). Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1 (1 lần lặp lại) 42oC trong 40 phút, 95oC trong 3 phút; chu kỳ 2 (35 lần lặp lại) 94oC trong 30 giây, 60oC trong 20 giây, 72oC trong 30 giây; chu kỳ 3 (1 lần lặp lại) 72oC trong 10 phút. Sản phẩm khuyếch đại có kích thước 197bp được phân tích trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng ethidium bromide. Chụp và phân tích hình ảnh.
Phương pháp RT-PCR hai bước với bước tổng hợp cDNA từ mồi ngẫu nhiên (random hexamer) theo bộ kit tổng hợ cDNA (NK cDNA- SYNTHESIS). Thực hiện phản ứng bằng cách hút 9µl RNA tách chiết vào 3µl RT-RTmix bao gồm 0,2mM dNTPs, mồi ngẫu nhiên 35pmol, RNAsin 1u/µl và đệm Reverse transcription 1X. Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1: 25oC trong 5 phút, chu kỳ 2: 42oC trong 30 phút, chu kỳ 3: 85oC trong 5 phút. Sản phẩm cDNA được dùng để khuếch đại DNA
ở bước tổng hợp phản ứng PCR bằng cách lấy 5µl cDNA cho vào 20µl hỗn hợp PCR mix bao gồm 35pmol mỗi mồi 20AF và 20AR, đệm GoTaq® Flexi 1X, 0,2mM dNTPs, 2mM MgCl2, 1,25U taq® Polymerase, 200µM dUTP và 1uUNG. Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1 (1 lần lặp lại) 94oC trong 5 phút; chu kỳ 2 (40 lần lặp lại) 94oC trong 20 giây, 60oC trong 20 giây, 72oC trong 30 giây; chu kỳ 3 (1 lần lặp lại) 72oC trong 10 phút. Sản phẩm khuyếch đại có kích thước 197 bp được phân tích trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng ethidium bromide. Chụp và phân tích hình ảnh.
2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai được tính theo công thức:
Ta = (Tm mồi xuôi + Tm mồi ngược)/2 ± 5oC
Tiến hành: Để xác định nhiệt độ lai tối ưu, ta tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho cặp mồi LSNV 20F và LSNV 20AR trên một gradient nhiệt độ từ 52oC đến 62oC. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp
Một yêu cầu quan trọng của phương pháp là mồi phải khuếch đại đúng trình tự mục tiêu cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, mồi không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó, việc xác định độ đặc hiệu của phương pháp luôn luôn được đòi hỏi.
Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm bằng cách khảo sát khả năng bắt cặp của mồi lên các trình tự của các virus khác cũng gây bệnh cho tôm sú.
Tiến hành: Hai mẫu tôm đã được xác định bị nhiễm GAV, YHV được sử dụng để kiễm tra tính đặc hiệu của phương pháp. Các mẫu được ly trích RNA tổng số theo quy trình tách chiết RNA tổng số như mục 2.3.2.2. Sau đó thực hiện phản ứng
PCR. Sản phẩm khuếch đại sẽ được phân tích trên gel agarose 1,5% và nhuộm huỳnh quang với ethidium bromide. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình)
Với bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp.
Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của phương pháp RT- PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu RNA virus LSNV ban đầu thành nhiều nồng độ khác nhau (từ 10o đến 107 bản sao/2µl). Ở một nồng độ sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên. Từ đó độ nhạy của quy trình được xác định, đây chính là nồng độ khuôn thấp nhất nhưng vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.
2.2.4. Điện di trên gel agarose
2.2.4.1. Nguyên tắc
Trong thạch agarose pha và nhúng chìm trong đệm TBE 0,5X, sản phẩm PCR là các DNA sợi đôi nhờ mang điện tích âm sẽ bị di chuyển về phía cực dương và sự di chuyển này sẽ xa hay gần khởi điểm là tùy thuộc vào kích thước của sản phẩm PCR dài hay ngắn. sau khi điện di, các DNA kích thước giống hệt nhau sẽ tập trung thành lại thành vạch, gọi là băng DNA, nhìn thấy được nhờ các DNA sợi đôi bị nhuộm bởi ethidium bromide (ethidium bromide gắn kết với DNA bằng cách xen giữa các nucleotide) thành vạch phát huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím của hộp đèn UV. Dựa vào các băng kích thước của thang DNA mà kích thước của sản phẩm PCR có thể tính được hay ước lượng được.
Gel agarose được dùng để phân tích những đoạn có kích thước 0,5-20 kb, giúp phân tích kết quả PCR dựa trên kích thước sản phẩm khuếch đại được.
2.2.4.2. Phương pháp tiến hành
Pha dung dịch TBE 0,5X bằng cách cho 50ml TBE 10X vào một chai đã chứa sẵn 950ml nước cất, lắc đều.
Pha gel agarose 1,5% bằng cách trộn 0,6g agarose trong 40ml TBE 0,5X. Đun cho tan agarose hoàn toàn, để gel nguội xuống khoảng 50oC, cho vào gel 2µl ethidium bromide 10mg/ml, trộn hòa tan đều ethidium bromide vào trong gel, tránh làm gel có bọt khí khi trộn. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn. Sau đó đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị. Chờ đến khi gel đông đặc, gỡ bỏ lược, lấy bản gel ra khỏi khuôn. Đặt bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X cho ngập bản gel.
Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 2µl đệm tải (loading dye buffer) và 6-8µl mẫu thử đã chạy xong chương trình PCR, trộn đều. Tải các sản phẩm PCR đã trộn với đệm tải vào các giếng trên bản gel agarose đã nhúng chìm trong đệm TBE 0,5X ở máng điện di. Phải luôn luôn có một giếng giành cho thang DNA. Chạy điện di trong 20-30 phút ở dòng điện 90V. Sau khi chạy điện di xong (khi thấy vạch màu xanh cách xa giếng khoảng 2-2,5cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên hộp UV. Xem các băng DNA dưới tia sáng của đèn UV. So với thang DNA để biết kích thước của sản phẩm PCR. Chụp hình giữ kết quả.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết
3.1.1.1. Các thông số của mồi
Các đặc tính của mồi bao gồm: kích thước, nhiệt độ biến tính, tỷ lệ GC, cấu trúc thứ cấp… được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (http://www.idtdna.com). Kết quả trình bày trong bảng :
Bảng 3.1: Một số đặc tính của cặp mồi LSNV 20AF/20AR
Tên mồi Chiề u dài Thành phần GC(%) Nhiệt độ biến tínhTm(oC) Self- dimer ΔG (Kcal/mol) Hetero- dimer ΔG (Kcal/mol) 20AF 20AR 20 20 60 65 65.7 66.6 -3.61 -9.75 -6.68 -6.68 Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng:
Về kích thước: cặp mồi có chiều dài đạt yêu cầu (18 – 25bp), cho phép khả năng nhân bản tốt nhất.
Về nhiệt độ biến tính: sự chênh lệch nhiệt độ biến tính giữa mồi xuôi và mồi ngược không lớn, dao động trong khoảng cho phép, đảm bảo cho khả năng bắt cặp tốt nhất của chúng trong cùng điều kiện nhiệt độ.
Về thành phần GC: tỷ lệ GC nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất cho sự khuếch đại của mồi (40 – 65%).
Kết quả kiểm tra sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của các mồi cho thấy:
Các mồi đ ều có sự hình thành cấu trúc cặp tóc (hairpin) và cấu trúc tự mồi (self-dimer). Tuy nhiên, các cấu trúc này đều có năng lượng tự do G lớn hơn -9 kcal/mol (thường thì các cấu trúc thứ cấp có G lớn hơn -9 kcal/mol sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi) như kết quả trên hình 3.2 và hình 3.3.
Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR a. LSNV20AF
b. LSNV 20AR
Hình 3.3: Một số cấu trúc self- dimer của mồi
Về cấu trúc hetero-dimer: qua khảo sát cũng nhận thấy mồi xuôi và mồi ngược có sự hình thành cấu trúc hetero-dimer với nhau, tuy nhiên, tất cả các cấu trúc này đều có G lớn hơn – 9 kcal/mol (Hình 3.4).
b
3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi
Song song với việc kiểm tra các đặc tính của mồi, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc cũng như độ đặc hiệu của mồi trên lý thuyết.
Để khảo sát các yếu tố này, chúng tôi tiến hành BLAST từng trình tự mồi lên ngân hàng cơ sở dữ liệu Genebank của NCBI để tìm kiếm các trình tự tương đồng với trình tự này, sắp gióng các mồi với những trình tự chuẩn bằng phần mềm ClustalX.
Sau khi khảo sát, chúng tôi nhận thấy, các mồi bắt cặp 100% với các trình tự LSNV với tỷ lệ cao nhất (hình 3.5).
a. LSNV 20AF
b. LSNV 20AR
Hơn thế nữa, vị trí bắt cặp của các mồi có độ bảo tồn cao với các trình tự LSNV gây nhiễm.
>20AF TTGCCTTCTCCCGAGTGGTC
>20AR CCGGCTGAGGTAGCTGCTTG->reverse complement:
CAAGCAGCTACCTCAGCCGG
>DQ127905.1| Laem Singh virus putative RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) mRNA, partial cds CGTTGCCTTCTCCCGAGTGGTCAGGTTTACGCGCAAGAGTTCTCAGGCTTCATGAAGTCA GGCATTGTGAATACTATCTCCACCAATTCTCATGCCCAGATCATGCTGCATATGCTTGCTTG CAAGCGCTCGGGTGAGCCCGTGACTCCTATATTAGCCTGCGGTGATGACACTATTCAAGCA GCTACCTCAGCCGGTTATATTGAAGAGCTGGCGAAGGCAGGGTGCATTGTTAAGAGTGTCG ATCGCAAGCTAGAGTTTATGGGTTTTAACTTTGAGGGCGCCATGCAACCAATCTACACCAT GAAACACATCGCATCTTTTACTTATAAGAGTGAGGAGCTTCATGGTGAGATTTTAGATAGC ATGTGCAGAATGTACGCTCACCACCCCTGGTTTGACTGTTGGAAGATGTTAGCAGGCTCTT TGGGCCATAATATGAAGTCTAGAGCCTGGTATCAGTTCTTCCTTGATAGTACAGCCAATAT CAGGATCACGAAGTCCATTTAGATAGAGGATGACGTGAGCTGGCTATGTTTTCTACCTTTC CTGTAACGTGGCGGTTCTGAGGGGGCGTGTGCCAATACGTTTCTGGGGCAAAAAAAAAAA AAAAAA
Hình 3.6: Kết quả sắp gióng các mồi với trình tự chuẩn DQ127905.1
Kết quả trên cho thấy cặp mồi LSNV cho kết quả bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu. Từ kết quả trên chúng tôi có thể kết luận, trên lý thuyết LSNV 20AF/AR có thể bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu và có độ đặc hiệu cao.
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR phản ứng PCR
3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế
Để kiểm tra hoạt động của mồi sau khi tổng hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng RT- PCR theo quy trình RT- PCR một bước của Sritunyalucksana (2006) và RT- PCR hai bước. Sau đó điện di trên gel agarose 1.5% với chứng dương cung cấp bởi RIA2 (hình 3.7).
Giếng M: Thang chuẩn DNA 100bp Giếng 1 : Mẫu âm tính
Hình 3.7: Kết quả áp dụng quy trình RT-PCR trên mẫu dương tính
Qua kết quả trên cho thấy: