a. Nguyên tắc
Phương pháp RT-PCR một bước
Phương pháp này thực hiện hai giai đoạn RT và PCR trong cùng một ống phản ứng, nghĩa là sau khi cho tách chiết RNA từ mẫu thử cho vào ống phản ứng, giai đoạn RT sẽ được thực hiện trước và sau đó giai đoạn PCR sẽ đi liền theo sau. Để thực hiện được RT-PCR một bước, trong ống phản ứng phải có đủ các thành phần hóa chất và thuốc thử để chạy RT và PCR, tức là phải có cả enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT và enzyme Taq polymerase chịu nhiệt sử dụng cho PCR. Trong phương pháp RT-PCR một bước, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham
gia vào phản ứng PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT.
Phương pháp RT-PCR hai bước:
Tiến hành thực hiện giai đoạn RT tổng hợp cDNA trong một ống phản ứng, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích cần tìm. Phương pháp này có nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp ống PCR để cho cDNA vào. Do vậy trong phản ứng PCR thường cho thêm dUTP và UNG vào PCR mix để tránh ngoại nhiễm.
b. Phương pháp tiến hành
Phương pháp RT- PCR phát hiện virus LSNV được tối ưu hóa các điều kiện phản ứng thành kỹ thuật RT-PCR một bước với hệ thống hóa chất của hãng Promega và mồi 20AF và 20AR nhận diện và khuếch đại đặc hiệu một vùng trình tự vật liệu di truyền có kích thước 197bp của virus LSNV. Thực hiện phản ứng RT- PCR một bước bằng cách hút 2µl dịch ly trích RNA tổng số của mẫu cần phân tích cho vào 23µl hỗn hợp hóa chất phản ứng RT-PCR bao gồm 35pmol mỗi mồi 20AF và 20AR, đệm Colorless GoTaq® Flexi 1X, 0,2mM dNTPs, 2mM MgCl2, 5U AMV Reverse trancriptase, 1,25U Gotaq® Hotstart Polymerase (Promega, Mỹ). Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1 (1 lần lặp lại) 42oC trong 40 phút, 95oC trong 3 phút; chu kỳ 2 (35 lần lặp lại) 94oC trong 30 giây, 60oC trong 20 giây, 72oC trong 30 giây; chu kỳ 3 (1 lần lặp lại) 72oC trong 10 phút. Sản phẩm khuyếch đại có kích thước 197bp được phân tích trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng ethidium bromide. Chụp và phân tích hình ảnh.
Phương pháp RT-PCR hai bước với bước tổng hợp cDNA từ mồi ngẫu nhiên (random hexamer) theo bộ kit tổng hợ cDNA (NK cDNA- SYNTHESIS). Thực hiện phản ứng bằng cách hút 9µl RNA tách chiết vào 3µl RT-RTmix bao gồm 0,2mM dNTPs, mồi ngẫu nhiên 35pmol, RNAsin 1u/µl và đệm Reverse transcription 1X. Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1: 25oC trong 5 phút, chu kỳ 2: 42oC trong 30 phút, chu kỳ 3: 85oC trong 5 phút. Sản phẩm cDNA được dùng để khuếch đại DNA
ở bước tổng hợp phản ứng PCR bằng cách lấy 5µl cDNA cho vào 20µl hỗn hợp PCR mix bao gồm 35pmol mỗi mồi 20AF và 20AR, đệm GoTaq® Flexi 1X, 0,2mM dNTPs, 2mM MgCl2, 1,25U taq® Polymerase, 200µM dUTP và 1uUNG. Thông số luân nhiệt như sau: chu kỳ 1 (1 lần lặp lại) 94oC trong 5 phút; chu kỳ 2 (40 lần lặp lại) 94oC trong 20 giây, 60oC trong 20 giây, 72oC trong 30 giây; chu kỳ 3 (1 lần lặp lại) 72oC trong 10 phút. Sản phẩm khuyếch đại có kích thước 197 bp được phân tích trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng ethidium bromide. Chụp và phân tích hình ảnh.