Chương trình PCR đòi hỏi một chuỗi lặp lại các chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước cơ bản: biến tính DNA khuôn mạch kép, bắt cặp của 2 mồi với mạch khuôn đơn và sự kéo dài mồi nhờ enzyme để tạo ra các bản sao mà đóng vai trò làm khuôn trong các chu kỳ sau đó.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính (hình 1.10):
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 – 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút, làm phá vỡ các liên kết hydro giúp phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
nhiệt độ nóng chảy của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 – 70oC, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của Taq polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 72oC, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.
Chu kỳ ba giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân và theo tính toán, sau n (25≤ n ≤ 40) chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 2n so với số lượng bản mẫu ban đầu.
Hình 1.10: Chu kì của phản ứng PCR
(Nguồn: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html)