Sau khi tổng hợp 10 chất 3(a-j), tác giả đã thử nghiệm hoạt tính trên các dịng tế ào A549 (tế ào ung thƣ phổi ngƣời), MCF-7 (tế ào ung thƣ vú ở ngƣời), HT29 (tế ào ung thƣ ruột kết). Kết quả cho thấy hợp chất 3 (IC50 = 7.8 µM) và 3e (IC50 = 23.9 µM) đối với HT29, các hợp chất 3f (IC50 = 19.1 µM), 3g (IC50 = 44.7 µM) và 3i (IC50 = 24.5 µM) ức chế tốt với MCF-7, hợp chất 3h (IC50= 9.7 µM) và 3i (IC50 = 8.5 µM) ức chế tốt đối với A549 và 3 (IC50 = 86.33 µM) kháng oxy hóa hiệu quả.
20
1.4 Cơ sở lựa chọn các nhóm chức của các hợp chất trung gian và các nhóm thế của các sản phẩm chính thế của các sản phẩm chính
Hình 1.37 Các sản phẩm trung gian và sản phẩm chính (5a-e)
1.4.1 Cơ sở lựa chọn các nhóm chức của hợp chất trung gian (1-4)
Hợp chất (1) có chứa nhóm Ethyl (C2H5) với N, đây là nhóm đẩy điện tử sẽ định
hƣớng liên kết CHO vào nhân vòng thơm - hợp chất trung gian (2). Với mục đích sau đó nhóm CHO này sẽ tạo liên kết với thiosemicar azide tạo hợp chất trung gian
(4). Cuối cùng sẽ đƣợc đóng vịng với α-bromo ketone tạo các sản phẩm (5a-e).
Hợp chất trung gian (3) có chứa liên kết C-Br, nhằm ảo vệ nhóm chức CHO trong quá trình phản ứng tạo hợp chất trung gian (4).
1.4.2 Cơ sở lựa chọn các nhóm thế của các sản phẩm chính (5a-e)
Các sản phẩm chính (5a-e) đƣợc đóng vịng tuần tự qua phản ứng giữa hợp chất
trung gian (4) và các α-bromo ketone. Các sản phẩm chính vừa chứa dị vịng
carbazole và 1,3-thiazole mang nhóm thế ở vị trí 2,4.
Các α-bromo ketone đƣợc lựa chọn để cho sản phẩm cuối cùng là những hợp chất hoàn toàn mới. Các sản phẩm cuối cùng (5a)-N(CH3)2, (5b)-N3, (5d)-N(CH2)4 có chứa nhóm thế đẩy điện tử. Trong khi đó các sản phẩm (5c)-SO2F và (5e)-OCHF2
chứa nhóm hút điện tử. Các sản phẩm (5a-e) sau khi tổng hợp sẽ đƣợc khảo sát các hoạt tính sinh học (kháng ung thƣ, kháng khuẩn, kháng nấm), đƣợc so sánh các hoạt tính dựa trên các cấu trúc.
21
THỰC NGHIỆM CHƢƠNG 2
Quy trình thực nghiệm tổng hợp 1,3-thiazole trải qua 5 ƣớc chính [75-78]: - Ethyl hóa carbazole (N-alkyl hóa).
- Car onyl hóa ethylcar azole (Car onyl hóa dị vịng thơm). - Brom hóa ethyl carbazole carbonyl.
- Cộng với thiosemicar azide của romoethyl car azole car onyl hình thành thiosemicarbazone.
- Bromoethyl thiosemicar azone thực hiện phản ứng đóng vịng lần lƣợt với 5 dẫn xuất tuần tự của 2- romoketone để hình thành 5 dẫn xuất 1,3-thiazole mới mang nhóm thế ở vị trí 2,4. Carbazole Hợp chất trung gian (1) Hợp chất trung gian (2) Hợp chất trung gian (3) Hợp chất trung gian (4) Sản phẩm (5a-e) Q trình ethyl hóa Q trình carbonyl hóa Q trình brom hóa Q trình cộng Thiosemicarbazide Đóng vịng với α-bromoketone
22
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình thực nghiệm tổng hợp dẫn xuất 1,3-thiazole (5a-e) và các hợp chất trung gian (1-4)
23
2.1 Tổng hợp hợp chất trung gian (1)
2.1.1 Phương trình phản ứng
Hình 2.3 Phƣơng trình phản ứng tổng hợp hợp chất trung gian (1)
2.1.2 Hóa chất
Carbazole, C2H5Br, KOH, DMSO, TBAHS
Bảng 2.1 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp hợp chất trung gian (1)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Công thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C12H9N ≥ 95.0 % Carbazole 167.21 Sigma Aldrich C2H5Br ≥ 98.0 % Bromo ethane 108.97 Sigma aldrich KOH ≥ 85.0 % Potassium hydroxide - 56.11 Trung Quốc DMSO ≥ 99.5 % Dimethyl sulfoxide 78.13 Sigma aldrich TBAHS ≥ 97.0 % Tetrabutyl ammonium hydrogen sulfate 339.53 Sigma aldrich
24
Bảng 2.2 Bảng tính hóa chất tổng hợp hợp chất trung gian (1)
Thông số Carbazole C2H5Br KOH DMSO TBAHS
M (g/mol) 167.21 108.97 56 78.13 339.53 Tỷ lệ mol 1 1.5 2.5 42.2 0.05 n (mol) 0.0900 0.1350 0.2250 3.7980 0.0050 m (g) 15.00 14.710 12.60 296.73 1.53 V (mL) - 10.08 - 260.00 - d (g/mL) - 1.46 - 1.100 - 2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm
Bình cầu 3 cổ 500 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, ống sinh hàn, nhiệt kế, chậu thủy tinh gia nhiệt và dầu máy gia nhiệt.
Hình 2.4 Lắp đặt thiết ị phản ứng tổng hợp HCTG (1)
2.1.4 Quy trình thực nghiệm
Cho KOH (225 mmol) và DMSO (260 mL) vào ình cầu, khuấy ở nhiệt độ 60oC trong 1.5 giờ. Cho carbazole (90 mmol) vào ình cầu, tiếp theo thêm tiếp TBAHS (5 mmol), cuối cùng cho thêm C2H5Br (135 mmol). Duy trì phản ứng ở nhiệt độ 60- 70oC trong 20 giờ. Tiến hành kiểm tra sắc ký ảng mỏng sau mỗi 2 giờ. Khi phản ứng kết thúc, để nguội trong khoảng 1-2 giờ, tiến hành thêm nƣớc và chờ kết tinh
25
trong khoảng 3-4 giờ. Tiến hành lọc qua giấy lọc để thu chất rắn. Quy trình tổng hợp hợp chất trung gian (1) đƣợc tóm tắt trong (Hình 2.5).
Sau khi thu hồi tiến hành rửa qua MeOH để làm sạch sản phẩm và thu đƣợc 13.80 g hợp chất trung gian (1). KOH (225 mmol) DMSO (260 mL) Khuấy 1.5 giờ 60 oC Phản ứng 20 giờ 60-70 oC Để nguội (1-2 giờ) Chờ kết tinh Lọc lấy chất rắn Thêm nƣớc Carbazole (90 mmol) TBAHS (5 mmol) C2H5Br (135 mmol) Hợp chất trung gian (1)
Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tổng hợp hợp chất trung gian (1)
2.1.5 Kiểm tra phản ứng và xử lý sản phẩm
Phƣơng pháp sắc ký ảng mỏng sử dụng trong luận v n này dùng để nhận iết vết hợp chất trung gian (1) và thời gian kết thúc phản ứng. Pha t nh là ảng sắc ký một mặt phủ silicagel, mặt còn lại tráng nhôm. Pha động là hệ dung môi giải ly EA/n- hexan. Chất trung gian (1) đƣợc hút ằng mao quản pasterpipet và chấm ở đƣờng kẻ bút chì (Hình 2.7) đƣợc đặt trong ình thủy tinh để pha động di chuyển từ điểm xuất phát đến điểm kết thúc, ảng mỏng sau khi đƣợc giải ly đƣợc phát hiện dƣới đèn UV (sử dụng đèn UV philip 8W có ƣớc sóng 254 nm-Hình 2.6) sẽ hiển thị kết quả.
26
Hình 2.6 Đèn UV Philip sử dụng để kiểm tra ảng mỏng
Hình 2.7 Bình và ảng mỏng thực hiện sắc ký ảng mỏng
Hình 2.8 Sắc ký ảng mỏng của HCTG (1) sau 20 giờ phản ứng Trong đó: 1: Vết carbazole
2: Vết hợp chất trung gian (1)
Car azole đƣợc hòa tan trong CHCl3 với lƣợng đủ chấm để kiểm tra ằng mao quản. Sau khi chấm thì ảng mỏng đƣợc giải ly trong dung môi Ethyl acetat và n- hexan, với tỷ lệ thể tích là 20% EA/n-hexan.
27 Nhận xét:
Sau 20 giờ phản ứng, trên sắc ký ảng mỏng hợp chất carbazole đã hết, ên dung dịch phản ứng (2) chỉ có sản phẩm đƣợc sinh ra, lúc này có thể dừng phản ứng (Hình 2.8).
Sau khi lọc thu hồi đƣợc chất, kiểm tra ằng sắc ký ảng mỏng một lần nữa, sản phẩm (2) có tạp chất tuyến trên và tuyến dƣới ảng, tiến hành rửa qua MeOH (40oC). Sau khi rửa xong, tiến hành lọc để thu hồi chất rắn. So sánh sắc ký ảng mỏng giữa chất rắn và nƣớc lọc, nhận thấy nƣớc lọc đã hòa tan đƣợc chất ẩn, phần chất rắn thu đƣợc chỉ có một vệt duy nhất (Hình 2.9).
a) b)
Hình 2.9 Sản phẩm (1) trƣớc (a) và sau (b) khi rửa ằng MeOH
Trong đó: a) b)
1: Vết car azole 1: Vết HCTG (1) tinh khiết 2: Vết HCTG (1) - trƣớc rửa 2: Vết HCTG (1) - nƣớc rửa
28
2.2 Tổng hợp hợp chất trung gian (2)
2.2.1 Phương trình phản ứng
Hình 2.11 Phƣơng trình phản ứng tổng hợp hợp chất trung gian (2)
2.2.2 Hóa chất
Hợp chất (1), Dimethyl formamide, phosphorus trichloride oxide, Chloroform,
sodium sulfate anhydrous, sodium hydroxide. Ngồi ra cịn sử dụng thêm silicagel, n-hexan và ethyl acetate để thực hiện quá trình làm sạch hợp chất trung gian (2)
ằng sắc ký cột cổ điển.
Bảng 2.3 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp hợp chất trung gian (2)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Công thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C14H13N Hợp chất (1) 195.26 Tổng hợp DMF ≥ 99.9 % Dimethyl formamide 73.09 Pháp POCl3 ≥ 98 % Phosphorus trichloride oxide 153.33 Trung Quốc CHCl3 ≥ 99.0 % Chloroform 119.38 Sigma aldrich Na2SO4 ≥ 99.0 % Sodium sulfate anhydrous - 142.04 Trung Quốc Silicagel Silicagel 230-400 mesh - - Ấn Độ
NaOH Sodium hydroxide - - Trung
29
Bảng 2.4 Bảng tính hóa chất tổng hợp hợp chất trung gian (2)
Thông số Hợp chất (1) DMF POCl3 CHCl3 M (g/mol) 195.26 73.09 155.33 119.38 Tỷ lệ mol 1 2 2 20 n (mol) 0.0660 0.1320 0.1320 1.320 m (g) 13.00 9.65 20.50 157.58 V (mL) - 10.17 12.24 160 d (g/mL) - 0.949 1.675 - 2.2.3 Dụng cụ thí nghiệm
Bình cầu 3 cổ 500 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, ống sinh hàn, nhiệt kế, chậu thủy tinh gia nhiệt, dầu gia nhiệt, phễu chiết và hệ thống khí N2.
Hình 2.12 Sơ đồ lắp đặt thiết ị phản ứng tổng hợp HCTG (2)
Phản ứng này đƣợc lắp đặt thêm hệ thống khí N2 nhằm mục đích tạo mơi trƣờng khí trơ cho phản ứng, do hợp chất POCl3 dễ ị phân hủy. Phễu chiết để nhỏ từ từ POCl3 trong CHCl3 vào bình phản ứng đã chứa DMF, hợp chất trung gian (1) và dung môi CHCl3. Trƣớc khi cho tác chất vào ình phản ứng, khí N2 sẽ đƣợc cho vào bình phản ứng trƣớc tạo mơi trƣờng khí trơ.
30
2.2.4 Quy trình thực nghiệm
Hợp chất trung gian (1) (66 mmol)
Hịa tan
Phễu chiết nhỏ giọt CHCl3 (80 mL), POCl3 (132 mmol) Phản ứng 72 giờ 60-70 oC Để nguội Điều chỉnh pH=7 Chiết ằng CHCl3 Thêm NaOH 10% CHCl3 (80 mL), DMF (132 mmol) Làm khan ằng Na2SO4 Lọc lấy phần lỏng Cô quay
Kết tinh lại trong n-hexan
Lọc lấy chất rắn
Hợp chất trung gian (2)
Hình 2.13 Sơ đồ quy trình tổng hợp hợp chất trung gian (2)
Cho hợp chất (1) (66 mmol) vào ình cầu 3 cổ, cho CHCl3 vào để hịa tan, tiếp theo cho DMF (132 mmol) vào bình cầu. Phần CHCl3 còn lại và POCl3 (132 mmol) vào phễu chiết sau đó nhỏ từ từ vào ình cầu (tốc độ 1 giọt/2s). Quá trình trên đƣợc thực hiện đồng thời với việc mở van khí N2. Phản ứng đƣợc giữ ở nhiệt độ 60 - 70o
C, trong 72 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, chuyển dung dịch phản ứng ra khỏi ình phản ứng, cho vào ercher. Thêm dung dịch NaOH 10% để đạt pH = 7. Chuyển dung dịch qua phễu chiết. Cho CHCl3 vào để chiết hết lƣợng sản phẩm ị hòa tan trong NaOH. Sau đó chiết tách đƣa ra ngồi. Thêm Na2SO4 khan để hút nƣớc, sau đó lọc và đem đi cơ quay. Sản phẩm sau khi cô quay ở dạng sệt và thêm n-hexan để
31
kết tinh. Chất rắn sau khi kết tinh đƣợc lọc và thu hồi. Quy trình tổng hợp hợp chất
(2) đƣợc tóm tắt lại trong (Hình 2.13).
Sản phẩm khơng tinh khiết nên đƣợc chạy sắc ký cột ằng silicagel để làm sạch và loại ỏ tạp chất với dung môi giải ly 15%EA/n-hexan. Sau khi làm sạch ta thu đƣơc 6.12 g hợp chất trung gian (2) tinh khiết.
2.2.5 Kiểm tra phản ứng và xử lý sản phẩm
Phản ứng đƣợc theo dõi liên tục ằng TLC, để kiểm tra phản ứng khi nào kết thúc. Từ đó có nhận xét về q trình thực hiện.
a) b)
Hình 2.14 Sắc ký ảng mỏng của phản ứng sau 48 và 72 giờ phản ứng
Trong đó: a) Sau 48 giờ b) Sau 72 giờ
1: Vết carbazole 1: Vết HCTG (1)
2: Vết HCTG (1) 2: Vết HCTG (2)
3: Vết HCTG (2) Nhận xét:
Sau 48 giờ phản ứng, nhận thấy hợp chất (2) vẫn cịn nên tiếp tục duy trì phản ứng. Do Rf của chất (2) và (3) vẫn còn ằng nhau (Hình 2.14). Các chất đƣợc chấm lên
32
ảng mỏng và giải ly trong dung môi 10% EA/n-hexan. Sau 72 giờ phản ứng, nhận thấy hợp chất trung gian (1) đã hết, tiến hành ngƣng phản ứng.
Hình 2.15 Sắc ký ảng mỏng của hợp chất (2) rắn sau kết tinh và rửa trong dung mơi n-hexan
Trong đó: 1: HCTG (2) rắn sau rửa 2: Dung môi rửa (n-hexan)
Mặc dù rửa qua ằng n-hexan có loại ỏ đƣợc tạp chất nhƣng vẫn khơng có hiệu quả đáng kể (Hình 2.15). Tiến hành xử lý ằng sắc ký cột để làm sạch hợp chất trung gian (2) sau tổng hợp. Sắc ký cột sử dụng dung môi 15% EA/n-hexan.
33
Hình 2.17 Sắc ký ảng mỏng của sắc ký cột hợp chất trung gian (2) Trong đó: Alde: Sản phẩm (2) trƣớc khi làm sạch ằng sắc ký cột
1, 2: Các ình giải ly đầu cột
20 : Sắc ký ảng mỏng phân đoạn tinh khiết 31 : Sắc ký ảng mỏng phân đoạn cuối cột
Tiến hành dồn các phân đoạn tinh khiết đem đi cô quay. Dung môi giải ly cột là 15%EA/n-hexan. Các bình hứng sẽ đƣợc thu hồi sau đó đem đi cơ quay và kiểm tra ằng sắc ký ảng mỏng liên tục, để so sánh với chất đầu cột ( ao gồm các ình có hợp chất trung gian (2) và các ình lẫn tạp chất).
Hình 2.18 Hợp chất trung gian (2) sau khi sắc ký cột
2.3 Tổng hợp hợp chất trung gian (3)
2.3.1 Phương trình phản ứng
34
2.3.2 Hóa chất
Hợp chất trung gian (2), NBS, CHCl3, Na2SO4, n-hexan, silicagel.
Bảng 2.5 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp hợp chất trung gian (3)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Công thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C15H13NO Hợp chất (2) 223.27 Tổng hợp NBS ≥ 99.0 % N-Bromosuccinimide 73.09 Sigma aldrich CHCl3 ≥ 99.0 % Chloroform 119.38 Sigma aldrich Na2SO4 ≥ 99.0 % Sodium sulfate anhydrous - 142.04 Trung Quốc C6H14 n-hexan - 86.18 Việt Nam Silicagel 230-400 mesh (37-63µm) - Ấn Độ Bảng 2.6 Bảng tính hóa chất tổng hợp hợp chất trung gian (3)
Thông số Hợp chất (2) NBS CHCl3 M (g/mol) 223.27 177.98 119.38 Tỷ lệ mol 1.0 1.1 - n (mol) 0.0223 0.0245 - m (gam) 5.0000 4.3605 - V (mL) - - 20-30 2.3.3 Dụng cụ thí nghiệm
Bình cầu 3 cổ 500 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, ống sinh hàn, nhiệt kế, chậu thủy tinh gia nhiệt và dầu máy gia nhiệt.
35
Hình 2.20 Sơ đồ lắp đặt thiết ị phản ứng tổng hợp HCTG (3)
2.3.4 Quy trình thực nghiệm
Cho NBS (24.5 mmol) và CHCl3 vào ình phản ứng, khuấy tan. Tiếp tục thêm hợp chất trung gian (2) (22.3 mmol), phản ứng tiến hành ở nhiệt độ phòng. Phản ứng kết thúc sau 4 giờ phản ứng. Sản phẩm đƣợc cho vào phễu chiết, thêm nƣớc cất và CHCl3 vào để tiến hành chiết tách, rửa lại nƣớc muối NaCl ão hòa. Dịch chứa sản phẩm đƣợc làm khan nƣớc ằng Na2SO4 và lọc, sau đó đƣợc đem đi cơ quay. Sản phẩm đƣợc kết tinh trong n-hexan và lọc để thu hồi sản phẩm. Quy trình tổng hợp chất trung gian (3) đƣợc tóm tắt trong (Hình 2.21). Sau phản ứng và làm sạch thu
đƣợc 3.50 g hợp chất trung gian (3). NBS (24.5 mmol) CHCl3 (20 mL) Khuấy tan Phản ứng 4 giờ Nhiệt độ phòng
Chuyển vào phễu chiết
Lắc và chờ phân lớp
Chiết tách ằng CHCl3
Lần lƣợt thêm H2O và CHCl3
Rửa lại ằng dung dịch NaCl bão hịa
Chiết lấy phần tan trong CHCl3
Cơ quay thu hồi chất rắn
Kết tinh lại trong n-hexan
Lọc lấy phần rắn Làm khan nƣớc ằng Na2SO4 Lọc lấy phần lỏng Hợp chất trung gian (2) (22.3 mmol) Hợp chất trung gian (3) Hình 2.21 Sơ đồ quy trình tổng hợp hợp chất trung gian (3)
36
2.3.5 Kiểm tra phản ứng và xử lý sản phẩm
Phản ứng đƣợc theo dõi ằng sắc ký ảng mỏng, tách ằng sắc ký cột, thu chất tinh khiết và loại ỏ tạp chất. Hình 2.22 Sắc ký ảng mỏng (3) sau 1, 2, 4 và 6 giờ phản ứng Trong đó: 1: Vết HCTG (2) 2: Vết NBS 3: Vết HCTG (3) Nhận xét:
Hình 2.22 cho thấy vết HCTG (3) sau 4 giờ phản ứng thì vẫn cịn vết hợp chất (2), thêm 2.23 mmol NBS. Sau 6 giờ phản ứng thì HCTG (2) gần nhƣ đã hết. Tiến hành ngừng phản ứng và xử lý sản phẩm. Mặc dù HCTG (2) đã hết, nhƣng sản phẩm thu đƣợc lại có quá nhiều tạp chất. Sau phản ứng kết thúc, ta tiến hành xử lý ằng sắc ký cột.
37
a) b)
Hình 2.24 Sắc ký ảng mỏng khi xử lý ằng sắc ký cột: đầu cột (a)-cuối cột ( ) Trong đó: 1: Vết HCTG (3) trƣớc khi sắc ký cột
2: Vết HCTG (3) tinh khiết 3a: Vết HCTG (3) - đầu cột 3b: Vết HCTG (3) - cuối cột
Các bình giải ly đầu và cuối cột chứa nhiều vết chất ẩn nên đƣợc tách riêng, chỉ có các ình sạch khơng chứa chất ẩn mới đƣợc thu hồi riêng và dồn chung, cô quay và chuẩn ị cho phản ứng tiếp theo. Sắc ký cột giải ly ằng dung mơi 15%EA/n-hexan.
Hình 2.25 Hợp chất trung gian (3) sau khi xử lý sắc ký cột
2.4 Tổng hợp hợp chất trung gian (4)
2.4.1 Phương trình phản ứng
38
2.4.2 Hóa chất
Hợp chất trung gian (3), Thiosemicarbazide, C2H5OH, CH3COOH.
Bảng 2.7 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp hợp chất trung gian (4)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Công thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C15H12BrNO Hợp chất (3) 302.17 Tổng hợp NH2CSNHNH2 ≥ 99.0 % Thiosemicarbazide 91.14 Sigma aldrich C2H5OH 100 % Ethanol - 46.07 Sigma aldrich CH3COOH 100 % Acid acetic (glacial) - 60.05 Sigma aldrich
Bảng 2.8 Bảng tính hóa chất tổng hợp hợp chất trung gian (4)