52
2.8 Phản ứng điều chế sản phẩm (5d)
2.8.1 Phương trình phản ứng
Hình 2.50 Phƣơng trình phản ứng điều chế sản phẩm (5d)
2.8.2 Hóa chất
Hợp chất (4), 2-bromo-1-(4-(pyrrolidin-1-yl)phenyl)ethanone (α-bromo ketone d),
isopropyl alcohol, CH3COONa, C2H5OH.
Bảng 2.15 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp sản phẩm (5d)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Cơng thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C16H15BrN4S Hợp chất (4) 375.29 Tổng hợp C12H14BrNO ≥ 99.0 % 2-bromo-1-(4- (pyrrolidin -1- yl)phenyl)ethanone 268.15 Sigma aldrich (CH3)2CHOH
≥ 99.7 % Isopropyl alcohol 60.01 Trung
Quốc CH3COONa ≥ 99.0 % Sodium acetate anhydrous - 82.00 Trung Quốc
C2H5OH Ethanol - 46.00 Trung
53 Bảng 2.16 Bảng tính hóa chất tổng hợp sản phẩm (5d) Thông số Hợp chất (4) 2-bromo-1-(4-(pyrrolidin-1- yl)phenyl)ethanone Isopropyl alcohol CH3COONa M (g/mol) 376.35 268.15 60.01 82.00 Tỷ lệ mol 1.0 1.2 - 3.0 n (mol) 0.0013 0.0016 - 0.0039 m (g) 0.5000 0.4290 - 0.3198 V (mL) - - 15-20 - 2.8.3 Dụng cụ thực nghiệm
Bình cầu 2 cổ 50 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, ống sinh hàn, nhiệt kế, chậu thủy tinh gia nhiệt và dầu gia nhiệt.
Hình 2.51 Lắp đặt thiết ị phản ứng tổng hợp (5d)
2.8.4 Quy trình thực nghiệm
Cho hợp chất trung gian (4) (1.3 mmol) và 2-bromo-1-(4-(pyrrolidin-1-
yl)phenyl)ethanone (1.3 mmol) vào ình phản ứng, sau đó thêm isopropyl alcohol (10 mL) và CH3COONa (3.9 mmol). Trong quá trình phản ứng α-bromo ketone d hết, tiến hành ổ sung thêm 0.3 mmol. Phản ứng duy trì ở nhiệt độ 70 - 75o
C trong 6 giờ. Sau phản ứng, chất rắn đƣợc lọc và rửa qua EtOH. Quy trình tổng hợp sản phẩm (5d) đƣợc tóm tắt trong sơ đồ (Hình 2.52). Sau phản ứng và làm sạch thu đƣợc 0.4633 g chất rắn.
54 Hợp chất trung gian (4) (1.3 mmol) Phản ứng 6 giờ 70 - 75 oC Làm nguội Lọc lấy chất rắn Rửa ằng EtOH Thu chất rắn α -bromo ketone d (1.3 mmol) (CH3)2CHOH (10 mL) CH3COONa (3.9 mmol) Sản phẩm (5d) Thêm 0.3 mmol α -bromo ketone d Hình 2.52 Sơ đồ quy trình tổng hợp sản phẩm (5d) 2.8.5 Kiểm tra phản ứng và xử lý sản phẩm
Hình 2.53 Sắc ký ảng mỏng của hợp chất (5d) sau 4 và 6 giờ phản ứng Trong đó: 1: Vết HCTG (4)
2: α-bromo ketone d 3: Vết hợp chất (5d)
55 Nhận xét:
Sau 4 giờ phản ứng thì hợp chất trung gian (4) vẫn còn nhƣng α- romo ketone d đã hết, tiến hành ổ sung thêm 0.3 mmol. Sau 6 giờ thì hợp chất (4) và α-bromo ketone d đã hết (Hình 2.53). Chất rắn sau khi đƣợc sinh ra thì kết tinh trong ống mao quản khi chấm ảng mỏng, pha loãng trong CHCl3 để tiện cho việc theo dõi ằng sắc ký ảng mỏng. Tiến hành lọc để thu hồi chất rắn. Sắc ký ảng mỏng đƣợc giải ly trong hệ dung mơi 40% EA/n-hexan.
Hình 2.54 Sắc ký ảng mỏng của hợp chất (5d) sau khi lọc và rửa qua EtOH Trong đó: 1: Vết HCTG (4)
2: α-bromo ketone d 3: Vết hợp chất (5d)
Lƣợng CH3COONa hòa tan trong ethanol. Sau khi rửa lại ta thu đƣợc sản phẩm sạch.
56
2.9 Phản ứng điều chế sản phẩm (5e)
2.9.1 Phương trình phản ứng
Hình 2.56 Phƣơng trình phản ứng điều chế sản phẩm (5e)
2.9.2 Hóa chất
Hợp chất (4), 2-bromo-1-(4-(difluoromethoxy)phenyl)ethanone (α-bromo ketone e), isopropyl alcohol, CH3COONa, C2H5OH.
Bảng 2.17 Bảng hóa chất sử dụng tổng hợp sản phẩm (5e)
Hóa chất
Độ tinh khiết Danh pháp Công thức cấu tạo
Phân tử gam (g/mol) Nhà sản xuất C16H15BrN4S Hợp chất (4) 375.29 Tổng hợp C9H7BrF2O2 ≥ 95.0 % 2-bromo-1-(4- (difluoromethoxy) phenyl)ethanone 265.05 Sigma aldrich (CH3)2CHOH
≥ 99.7 % Isopropyl alcohol 60.01 Trung
Quốc CH3COONa ≥ 99.0 % Sodium acetate anhydrous - 82.00 Trung Quốc
C2H5OH Ethanol - 46.00 Trung
57 Bảng 2.18 Bảng tính hóa chất tổng hợp sản phẩm (5e) Thông số Hợp chất (4) 2-bromo-1-(4- (difluoromethoxy)phenyl) ethanone Isopropyl alcohol CH3COONa M (g/mol) 376.35 265.05 60.01 82.00 Tỷ lệ mol 1.0 1.1 - 3.0 n (mol) 0.0013 0.0013 - 0.0039 m (g) 0.5000 0.3446 - 0.3198 V (mL) - - 15-20 - 2.9.3 Dụng cụ thực nghiệm
Bình cầu 2 cổ 50 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, ống sinh hàn, nhiệt kế, chậu thủy tinh gia nhiệt và dầu gia nhiệt.
Hình 2.57 Lắp đặt thiết ị phản ứng tổng hợp (5e)
2.9.4 Quy trình thực nghiệm
Cho hợp chất trung gian (4) (1.3 mmol) và 2-bromo-1-(4-(difluoromethoxy)phenyl) ethanone (1.3 mmol) vào ình phản ứng, sau đó thêm isopropyl alcohol (10 mL) và CH3COONa (3.9 mmol). Trong quá trình phản ứng, α-bromo ketone e hết, tiến hành ổ sung thêm 0.1 mmol. Phản ứng duy trì ở nhiệt độ 70 - 75o
C trong 7 giờ. Sau phản ứng, chất rắn đƣợc lọc và rửa qua EtOH. Quy trình tổng hợp sản phẩm (5e)
đƣợc tóm tắt trong sơ đồ (Hình 2.58)
58 Hợp chất trung gian (4) (1.3 mmol) Phản ứng 7 giờ 70 - 75 oC Làm nguội Lọc chất rắn Rửa ằng EtOH Thu chất rắn α-bromo ketone e (1.3 mmol) (CH3)2CHOH (10 mL) CH3COONa (3.9 mmol) Sản phẩm (5e) Thêm 0.1 mmol α-bromo ketone e
Hình 2.58 Sơ đồ quy trình tổng hợp sản phẩm (5e)
2.9.5 Kiểm tra phản ứng và xử lý sản phẩm
Hình 2.59 Sắc ký ảng mỏng của hợp chất (5e) sau 4.5 và 6 giờ phản ứng Trong đó: 1: Vết HCTG (4)
2: α-bromo ketone e 3: Vết hợp chất (5e)
59 Nhận xét:
Sau 4.5 giờ phản ứng thì hợp chất trung gian (4) vẫn còn. Nhƣng phản ứng sau 6
giờ thì hợp chất trung gian (4) đã hết (Hình 2.59). Sản phẩm sau khi đƣợc sinh ra thì kết tinh trong ống mao quản khi chấm ảng mỏng, nên cần pha loãng trong CHCl3 để tiện cho việc theo dõi ằng sắc ký ảng mỏng. Tiến hành lọc để thu hồi chất.
Hình 2.60 Sắc ký ảng mỏng hợp chất (5e) sau khi lọc và rửa qua EtOH Trong đó: 1: Vết HCTG (4)
2: α-bromo ketone e 3: Vết hợp chất (5e)
Bảng mỏng đƣợc giải ly trong hệ dung môi 30% EA/n-hexan.
Lƣợng CH3COONa ị cuốn theo ethanol. Sau khi rửa lại ta thu đƣợc sản phẩm sạch.
60
2.10 Kiểm tra xác định cấu trúc
Nhận diện cấu trúc của các hợp chất ằng các phƣơng pháp hóa lý nhƣ: FT-IR, NMR 1H và 13C, DEPT [75-78].
2.10.1 Phương pháp FT-IR
FT-IR đƣợc đo ằng máy The Bruker Tensor 37 FT-IR, khoa Cơng nghệ Hóa học, Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, số 12 Nguyễn V n Bảo, Phƣờng 4, quận Gò Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.10.2 Phương pháp phổ NMR
1
H,13C-NMR và DEPT đƣợc đo ằng máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, tại Phịng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.10.3 Phương pháp khối phổ MS
Phổ khối lƣợng MS thực hiện ằng phƣơng pháp phun mù điện, ằng máy microOTOF-Q II, phòng phân tích Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 01 Mạc Đ nh Chi, Phƣờng Bến Nghé, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh.
Bảng 2.19 Các phƣơng pháp phân tích hóa lý đã đƣợc sử dụng
Phƣơng pháp hóa lý 1 2 3 4 5 a b c d e FT-IR NMR 1 H 13 C - DEPT - MS - - - - 2.11 Xác định các hoạt tính sinh học
Sáu hợp chất ao gồm sản phẩm (4) và sản phẩm (5a-e) đƣợc thực hiện theo các thí nghiệm sinh học (in-vitro) nhƣ sau [75-78].
61
2.11.1 Hoạt tính kháng ung thư vú
Sử dụng phƣơng pháp MTT [79-80], thực hiện tại phòng Dƣợc lý, Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, số 41 Đinh Tiên Hồng, phƣờng Bến Nghé, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.11.1.1 Khảo sát độc tế bào invitro bằng phương pháp MTT
Các hợp chất trung gian (4) và hợp chất sản phẩm (5a-e) đƣợc thử nghiệm hoạt tính trên tế ào ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-231.
Tiến hành: Dung dịch các hợp chất đƣợc pha trong DMSO ở nồng khác nhau: các hợp chất tinh khiết tổng hợp pha ở nồng độ 10 mM. Dung dịch các chất tổng hợp đƣợc ảo quản ở -20 oC, rã đơng và pha lỗng trong mơi trƣờng để đạt các nồng độ khảo sát, vô trùng ằng cách chiếu UV 60 phút trƣớc khi dùng.
Dòng tế ào ung thƣ vú, MDA-MB-231 đƣợc nuôi trong môi trƣờng EMEM, ổ sung 10% FCS, L-glutamin 2 mM, penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 µg/mL. Tế ào đƣợc ni trong ình ni cấy 75 cm2
, ủ ở 37 o
C, 5% CO2. Khi tế ào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70-80%), thu tế ào và chia vào đ a nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104
tế ào/cm2. Ủ ở 37 o
C, 5% CO2 qua đêm để tế ào ám lên ề mặt
đ a nuôi cấy và phát triển ổn định. Xử lý tế ào với mẫu thử ở nồng độ khác nhau trong 24 giờ đối với chất phân lập. Mẫu đối chứng pha trong DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ cuối cùng trong môi trƣờng (1%, 0,5%) và paclitaxel 10 M đƣợc tiến hành song song. Những mẫu có nồng độ DMSO dƣới 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của tế ào nên sử dụng số liệu của mẫu môi trƣờng không xử lý. Thực hiện 3 mẫu cho 1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ). Sau thời gian xử lý, xác định tỷ lệ tế ào sống theo phƣơng pháp MTT.
2.11.1.2 Khảo sát tỷ lệ tế bào sống theo phương pháp MTT
Nguyên lý: Tỷ lệ tế ào sống đƣợc xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế ào sống. SDH chuyển MTT [3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành tinh thể
62
formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch màu tím, đo OD ở 570 nm. Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế ào sống trong mẫu nuôi cấy.
2.11.2 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Kirby Bauer [81]. Đƣợc thực hiện tại khoa Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, số 12 Nguyễn V n Bảo, Phƣờng 4, Quận Gị Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh.
Bảng 2.20 Các chủng vi khuẩn, nấm mốc và nấm men đƣợc kiểm nghiệm
STT Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc
1
Gr+
Bacillus cereus Candida albicans Fusarium sp.
2 Bacillus subtilis Colletotrichum sp.
3 Staphylococcus aureus 4 Pseudomonas aeruginosa 5 Gr- Escherichia coli 6 Salmonella enterica 2.11.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Bảng 2.21 Thành phần môi trƣờng LB (Luria Bertani Medium)
STT Thành phần Khối lƣợng 1 Tryptone 10 g 2 Yeast extract 5 g 3 NaCl 10 g 4 Agar 15-20 g 5 Nƣớc cất đủ 1 lít
Các vi khuẩn kiểm nghiệm đƣợc ni trong môi trƣờng LB Broth cho đến khi đạt đƣợc độ đục 0.5 theo tiêu chuẩn McFarland. Dịch vi khuẩn này đƣợc sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các dung dịch 7-12 tƣơng ứng với các hợp chất
63
- 0,1mL dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đ a Petri chứa môi trƣờng LB Agar theo phƣơng pháp trãi đ a. Các đ a giấy thấm vô trùng chứa 20 l các dung dịch đƣợc đặt lên ề mặt đ a Petri đã dàn đều vi khuẩn.
- Tiếp theo, các đ a Petri đƣợc để yên trong 4oC cho dung dịch thấm vào môi trƣờng thạch trong 2 giờ và sau đó đƣợc đem ủ ở 37o
C trong 16-18 giờ. Đ a kháng sinh Gentamycin (Alphachem Company, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện ằng dung môi DMSO.
- Khả n ng kháng khuẩn của các dung dịch B1/B3/MM đối với các chủng vi khuẩn đƣợc đo ằng đƣờng kính vịng vơ khuẩn sau 16-18h ni ủ.
2.11.2.2 Hoạt tính kháng nấm
Trƣờng hợp nấm men Candida al icans đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ kiểm tra vi khuẩn với môi trƣờng dinh dƣỡng là môi trƣờng Hansen. Đ a kháng sinh Ketoconazole (Alphachem Company, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện ằng dung môi DMSO.
Bảng 2.22 Thành phần môi trƣờng Hansen STT Thành phần Khối lƣợng STT Thành phần Khối lƣợng 1 Glucose 50.0 g 2 Peptone 10.0 g 3 K2HPO4 3.0 g 4 MgSO4.7H2O 2.0 - 5.0 g 5 Agar 20 g 6 Nƣớc cất đủ 1 lít
Trƣờng hợp nấm mốc Fusarium sp. và Colletotrichum sp. đƣợc thực hiện với môi trƣờng dinh dƣỡng là môi trƣờng PGA và cấy điểm tại tâm Petri. Các dung dich Hóa chất đƣợc kiểm tra tƣơng tự nhƣ trong kiểm tra vi khuẩn.
64
Bảng 2.23 Thành phần môi trƣờng PGA (potato Glucose Agar)
STT Thành phần Khối lƣợng
1 Khoai tây 200 g
2 Glucose 20 g
3 Agar 20 g
4 Nƣớc cất đủ 1 lít
Đ a kháng sinh Ketoconazole (Alphachem Company, Việt Nam) đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng cho các thí nghiệm. Đối chứng âm đƣợc thực hiện ằng dung môi DMSO.
65
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CHƢƠNG 3
3.1 Hiệu suất phản ứng và phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất (1)
Hình 3.1 Cơng thức cấu tạo của hợp chất (1) Công thức phân tử: C14H13N
Đặc điểm: Là chất ột, màu vàng nhạt, tan trong dung môi chloroform. Sắc ký ảng mỏng: Cho một vết duy nhất hấp thu UV.
3.1.1 Hiệu suất phản ứng
Khối lƣợng hợp chất (1) thu đƣợc: m(1) = 13.8 g
Số mol hợp chất (1) theo lý thuyết: n(1) ly thuyet ncarbazole 0.09 mol Hiệu suất đƣợc tính nhƣ sau:
(1) (1) (1) (1) ly thuyet m / M 13.80 / 195.26 H (%) (100%) (100%) 78.53 (%) n 0.09 3.1.2 Kết quả phổ FT-IR
Phổ FT-IR của hợp chất (1) xác định dựa vào Phụ lục 1.1 và so sánh với tài liệu