Phƣơng pháp hóa lý 1 2 3 4 5 a b c d e FT-IR NMR 1 H 13 C - DEPT - MS - - - - 2.11 Xác định các hoạt tính sinh học
Sáu hợp chất ao gồm sản phẩm (4) và sản phẩm (5a-e) đƣợc thực hiện theo các thí nghiệm sinh học (in-vitro) nhƣ sau [75-78].
61
2.11.1 Hoạt tính kháng ung thư vú
Sử dụng phƣơng pháp MTT [79-80], thực hiện tại phòng Dƣợc lý, Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, số 41 Đinh Tiên Hồng, phƣờng Bến Nghé, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.11.1.1 Khảo sát độc tế bào invitro bằng phương pháp MTT
Các hợp chất trung gian (4) và hợp chất sản phẩm (5a-e) đƣợc thử nghiệm hoạt tính trên tế ào ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-231.
Tiến hành: Dung dịch các hợp chất đƣợc pha trong DMSO ở nồng khác nhau: các hợp chất tinh khiết tổng hợp pha ở nồng độ 10 mM. Dung dịch các chất tổng hợp đƣợc ảo quản ở -20 oC, rã đơng và pha lỗng trong mơi trƣờng để đạt các nồng độ khảo sát, vô trùng ằng cách chiếu UV 60 phút trƣớc khi dùng.
Dòng tế ào ung thƣ vú, MDA-MB-231 đƣợc nuôi trong môi trƣờng EMEM, ổ sung 10% FCS, L-glutamin 2 mM, penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 µg/mL. Tế ào đƣợc ni trong ình ni cấy 75 cm2
, ủ ở 37 o
C, 5% CO2. Khi tế ào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70-80%), thu tế ào và chia vào đ a nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104
tế ào/cm2. Ủ ở 37 o
C, 5% CO2 qua đêm để tế ào ám lên ề mặt
đ a nuôi cấy và phát triển ổn định. Xử lý tế ào với mẫu thử ở nồng độ khác nhau trong 24 giờ đối với chất phân lập. Mẫu đối chứng pha trong DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ cuối cùng trong môi trƣờng (1%, 0,5%) và paclitaxel 10 M đƣợc tiến hành song song. Những mẫu có nồng độ DMSO dƣới 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của tế ào nên sử dụng số liệu của mẫu môi trƣờng không xử lý. Thực hiện 3 mẫu cho 1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ). Sau thời gian xử lý, xác định tỷ lệ tế ào sống theo phƣơng pháp MTT.
2.11.1.2 Khảo sát tỷ lệ tế bào sống theo phương pháp MTT
Nguyên lý: Tỷ lệ tế ào sống đƣợc xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế ào sống. SDH chuyển MTT [3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành tinh thể
62
formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch màu tím, đo OD ở 570 nm. Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế ào sống trong mẫu ni cấy.
2.11.2 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Kirby Bauer [81]. Đƣợc thực hiện tại khoa Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, số 12 Nguyễn V n Bảo, Phƣờng 4, Quận Gị Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh.