Nguyên tắc: Phương pháp MTT (Mosmann, 1983) là một phương pháp định lượng theo cách so màu khá nhạy dùng cho việc xác định sự sống, tăng sinh và hoạt động của tế bào. Tế bào sống được trong một môi trường thì sẽ có sự hoạt động của
enzym dehydrogenase ty thể. Enzym này sẽ chuyển cơ chất MTT 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide màu vàng, tan trong nước
thành sản phẩm formazan màu xanh đen, không tan trong nước. Lượng formazan được
tạo thành phản ánh số tế bào sống (Mosmann, 1983, Gerlier và Thomasset, 1986, Gralier và cộng sự, 1988, Al-Rubeai và Spier, 1989). Qui trình thực hiện như sau:
Thực hiện các bước đến khi cấy tế bào vào đĩa 96 giếng giống như trong phương pháp nhuộm trypan blue.
Sau 48h ủ trong tủ nuôi 370C, 5% CO2, thay môi trường cũ bằng môi trường
mới có chứa sản phẩm theo các nồng độ 0.005, 0.010, 0.015, 0.020, 0.025 mg/ml.
Đặt đĩa vào tủ nuôi 370C, 5% CO2.
- Sau mỗi 24h, 48h, 72h khảo sát, thêm 10µl MTT vào mỗi giếng, ủ trong 4h. Sau
đó loại bỏ dịch nổi, rửa lại với DMSO. Đo mật độ quang bằng máy đo ELISA đĩa nhiều giếng ở bước sóng 570nm.
- Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của sản phẩm được tính
theo công thức:
H(%) = [(ODĐC – ODKS)/ ODĐC] x 100%
H: tỷ lệ gây chết tế bào ung thư
ODĐC: OD của lô đối chứng
ODKS: OD của lô khảo sát
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 15 lần. d. Phương pháp phân tích hình thái tế bào
Sau khi ủ với sản phẩm, các tế bào được rữa với PBS lạnh, trãi lên lame kính
và cố định ethanol 70% khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào cố định được rữa với PBS lạnh, nhuộm với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin, quan sát dưới kính hiển vi
(400x). Các tế bào apoptotic được nhận diện bằng những đặc điểm hình thái đặc trưng
(tế bào co lại, nhiễm sắc thể cô đặc, xuất hiện các bóng màng và sự hình thành các thể
apoptotic).
2.2.3.2. Phương pháp khảo sát tác dụng tăng cường sức khỏe
Bố trí thí nghiệm
Chuột được chia làm 3 lô, mỗi lô gồm 5 con.
Lô 1 (lô đối chứng – ĐC: chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/con/ngày.
Lô 2 (lô thí nghiệm – TN1): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 150 mg/kg bwt/ngày.
Lô 3 (lô thí nghiệm – TN2): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 200 mg/kg bwt/ngày.
Chuột được uống sản phẩm liên tục trong 14 ngày.
Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả bằng mô hình chuột bơi kiệt sức: sử dụng bể chứa nước cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20cm (mực nước 15cm), cột vào đuôi chuột miếng kim loại nặng 6g, thả chuột vào bể nước, đo thời gian từ thời điểm thả vào đến khi chuột không thể đưa mũi lên khỏi mặt nước.
Khảo sát thời gian bơi của chuột vào các ngày 0, ngày 7 (trước khi dùng sản phẩm) và ngày 14 (sau khi kết thúc dùng sản phẩm).
Đánh giá tác dụng tăng cường sức khỏe bằng cách so sánh thời gian bơi của
chuột trước và sau khi dùng sản phẩm ở lô thí nghiệm và lô đối chứng. 2.2.3.3. Phương pháp khảo sát tác dụng kháng viêm
Động vật thí nghiệm: 15 chuột nhắt trắng đực, cân nặng khoảng 28 – 30g.
Tạo mô hình chuột viêm đùi sau bằng phương pháp tiêm formol 2% vào cơ đùi liều đơn 0,1 ml/chuột.
Bố trí thí nghiệm
15 chuột nhắt trắng đực đã gây viêm, chia làm 3 lô thí nghiệm, mỗi lô gồm 5 con chuột.
Lô 1 (đối chứng âm – ĐC (–)): chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/con/ngày trong 5 ngày.
Lô 2 (đối chứng dương – ĐC (+)): chuột được cho uống Alpha chemotrypsin với liều 50 mg/kg/ngày trong 5 ngày.
Lô 3 (lô thí nghiệm – TN): chuột được cho uống sản phẩm ở nồng độ 200 mg/kg/ngày trong 5 ngày.
Đánh giá kết quả
Xác định thể tích đùi sau của chuột bằng phương pháp đo trực tiếp dùng dây và thước vạch 1mm.
Khảo sát liên tục 1 lần/ngày trong 5 ngày, sau 5 ngày, chỉ quan sát và tính thời điểm chuột lành hẳn ở các lô (hết viêm và đi bình thường).
Xác định thể tích V0 của chân chuột trước khi gây viêm bằng formol.
Xác định thể tích chân chuột V1, V2, V3, V4, V5 tại các ngày 1, 2, 3, 4 và 5 sau khi gây viêm.
Xác định tỉ lệ phù chân theo công thức % = x 100%
Trong đó: X là tỷ lệ phù chân chuột
Vt là thể tích chân chuột ở thời điểm t sau khi gây viêm Vo là thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
Tác dụng kháng viêm của sản phẩm được đánh giá bằng cách so sánh tỷ lệ phù chân giữa các lô chuột.
2.2.3.4. Phương pháp khảo sát tác dụng giảm đau
Động vật thí nghiệm: 15 chuột nhắt trắng cái, cân nặng khoảng 25g.
Tạo mô hình chuột gây đau nội tại bằng acid acetic: tiêm acid acetic 1% vào
màng bùng chuột với liều đơn 0.2 ml/chuột. Bố trí thí nghiệm
Lô 1 – đối chứng âm (ĐC –): chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/chuột.
Lô 2 – đối chứng dương (ĐC +): chuột được cho uống aspirin với liều 50 mg/kg.
Lô 3 – thí nghiệm (TN): chuột được cho uống sản phẩm với liều 250 mg/kg.
Đánh giá kết quả
Quan sát biểu hiện đau của chuột thông qua sự đau quặn ở bụng (co thắt bụng,
duỗi thẳng ít nhất một chân sau). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tính thời giantừ khi gây đau đến khi xuất hiện lần đau quặn đầu tiên.
Đếm số lần đau quặn của chuột trong 5 phút, kể từ khi xuất hiện cơn đau đầu
tiên.
Đánh giá tác dụng giảm đau của sản phẩm bằng cách so sánh số lần đau quặn
cũng như thời gian bắt đầu đau giữa các lô thí nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xử lý thống kê
Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê mô tả
và trình bày ở dạng số trung bình ± sai số chuẩn trung bình bằng phần mềm Microsoft
Excel 2007. Thực hiện so sánh sự khác biệt về các chỉ tiêu đánh giá giữa các lô thí
nghiệm bằng kiểm định t – Test: Two sample Assuming Unequal Variances – so sánh giá trị trung bình có phương sai khác nhau, với độ tin cậy 95%.
3.1. Kết quả tạo sản phẩm 3.1.1. Kết quả thu cao chiết 3.1.1. Kết quả thu cao chiết
3.1.1.1. Kết quả thu cao chiết capsaicin – ớt
Từ 1.5kg ớt tươi sau quá trình thu dịch chiết, cô quay và sấy khô thu được 121.23g cao chiết đặc. Capsaicin trong cao chiết được định lượng với kết quả như sau
(chi tiết xem phụ lục 1).
Dịch chiết sau khi cô quay và sấy ta thu được cao capsaicin - ớt ở dạng đặc, có
màu vàng đỏ đậm, dẻo, có vị cay, nồng.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng capsaicin thu được chiếm 11,3% cao chiết,
phù hợp với phân tích của Christopher A. Reilly về hàm lượng capsaicin trong các loại ớt trên thế giới đăng trên Journal Forensic Science năm 2001 [19].
3.1.1.2. Kết quả thu bột curcumin – nghệ
Từ 3kg nghệ tươi, thu được 62.5g bột curcumin – nghệ. Curcumin trong bột cao chiết được định lượng với kết quảnhư sau (chi tiết xem phụ lục 2)
Bột curcumin – nghệ thu được có màu vàng, mùi thơm đặc trưng của nghệ, khô, mịn.
Hàm lượng curcumin có trong cao chiết ethanol thu được là 108.8 mg/g, chiếm 10.88 % trong 1g cao chiết, so với hàm lượng 12.5% curcumin có
trong 1 gam cao chiết ethanol 50% trong báo cáo số EMEA/ HMPC/ 456848/2008 của trung tâm đánh giá dược phẩm châu Âu – EMEA (European Medicines Agency Evaluation) thì hàm lượng này chấp nhận
được.
3.1.1.3. Kết quả thu bột piperine- tiêu
Từ 1kg tiêu khô, trải qua quá trình thu dịch chiết, tạo sấy phun thu được 50g bột piperine – tiêu. Piperine trong bột cao chiết ethanol được định lượng với kết quả như
sau (chi tiết xem phụ lục 3)
Bột piperine – tiêu thu được có màu xanh đen, mùi thơm đặc trưng của tiêu, bột khô, mịn.
Hàm lượng piperine có trong cao chiết ethanol thu được là 75,02 mg/g chiếm 7,5 % trong 1 g cao chiết, cao hơn so với kết quả 5,8 % trong 1 g cao chiết do Sunita Shailajan phân tích đăng trên International Journal of Pharma and Bio Sciences V1(1)2010 [51].
3.1.1.4. Kết quả thu bột glycyrrhizin – cam thảo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ 1kg cam thảo khô, sau khi thu cao chiết, sấy phun thu được 100.5g bột glycyrrhizin – cam thảo. Bột thu được có cảm quan tốt: màu vàng, mịn, thơm, có vị
ngọt đặc trưng. Do khó khăn trong việc tìm chất chuẩn nên không định lượng được
hàm lượng glycyrrhyzin trong bột cao chiết. Tuy nhiên kết quảđịnh tính cho thấy trong bột cao cam thảo thu được có chứa glycyrrhyzin.
Kết quả trên cho thấy các bột nguyên liệu thu được có màu, mùi, vị phù hợp với từng nguyên liệu và đều có chứa hàm lượng cao các hoạt chất mong muốn. Như vậy các nguyên liệu này phù hợp cho tạo viên thực phẩm chức năng. Bên cạnh đó, phương
pháp tạo cao chiết đơn giản, dễ thực hiện, kết quả thu được tốt, nên thuận lợi cho tạo sản phẩm và giảm giá thành sản xuất.
Bột nguyên liệu phối trộn có màu vàng sậm đẹp mắt, vị cay, ngọt, mùi thơm, độ ẩm là 7% (đạt chỉ tiêu nhỏ hơn 10% của Bộ y tế Việt Nam về độ ẩm của các nguyên liệu đóng viên). Viên nang sử dụng là viên nang mềm, màu xanh dương nổi bật. Ưu điểm khi sử dụng loại viên nang này là không có hại, rẽ tiền, dễđóng viên, dễ sử dụng, thời gian bảo quản lâu (có thể tới 3 năm).
Hình 3.1. Bột phối trộn và viên nang sau khi hoàn thành
3.2. Kết quả khảo sát độc tính
3.2.1. Kết quả khảo sát độc tố cấp tính
3.2.1.1. Kết quảbước 1 – thử nghiệm ở liều đơn 2000 mg/kg
Chuột thí nghiệm được quan sát 72 giờ sau khi dùng sản phẩm ở liều đơn 2000
mg/kg với kết quả sau:
Tất cả các chuột đều sống, khỏe mạnh, ăn uống, đi lại hoàn toàn bình
Như vậy, không có độc tố cấp tính ở liều 2000 mg/kg. Tiếp tục tiến hành
bước 2 – thử nghiệm ở liều đơn 5000 mg/kg.
3.2.1.2. Kết quả bước 2 – thử nghiệm ở liều đơn 5000 mg/kg
Chuột thí nghiệm được quan sát 72 giờ sau khi dùng sản phẩm ở liều đơn 5000
mg/kg, kết quả tất cả các chuột đều sống, khỏe mạnh, ăn uống, đi lại hoàn toàn bình
thường; màu lông, màu mắt, màu da không có gì thay đổi.
Như vậy, theo qui định của tổ chức OECD và WHO thì sản phẩm không có độc
tố cấp tính và thí nghiệm được kết thúc [40].
3.2.2. Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn
Trong thời gian thí nghiệm biểu hiện của chuột hầu như không có sự khác biệt nhiều giữa các lô, chuột vẫn ăn uống, đi lại bình thường. Màu da, màu mắt, lông giữa các lô 1, 2, 3 không có gì khác nhau, tuy nhiên ở lô 4 sau 10 ngày thí nghiệm lông chuột có vẻxù hơn, ít vận động hơn.
Sau 14 ngày dùng sản phẩm, và quan sát tiếp tục thêm 72 giờ (không dùng sản phẩm), kết quả như sau: trong 25 chuột thí nghiệm 24 chuột vẫn khỏe mạnh bình
thường, chỉ có 1 con chuột ở lô 4 bị chết vào ngày thứ 12 của thí nghiệm. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn LÔ LÔ 1 (nước cất) LÔ 2 (150 mg/kg) LÔ 3 (200 mg/kg) LÔ 4 (250 mg/kg) Tỷ lệ chết 0% 0% 0% 20%
Kết quả cho thấy các liều sản phẩm thí nghiệm không gây độc tính bán trường
diễn (không xác định được LD50 do tỷ lệ chuột chết nhỏ hơn 50%). Ở nồng độ 150
mg/kg và 200 mg/kg chuột sống và phát triển bình thường, tỷ lệ chết là 0%, chứng tỏ
sử dụng sản phẩm ở các nồng độ này hoàn toàn không gây độc trên chuột. Ở nồng độ
250 mg/kg có 1 chuột chết. Nguyên nhân chuột chết chưa được xác định rõ, cần làm những nghiên cứu sâu hơn sau này để xác định cơ chế tác động của sản phẩm, cũng có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thể chuột chết do thao tác trong quá trình cho uống sản phẩm. Tuy nhiên các kết quả
trên cũng cho thấy ở nồng độ này sản phẩm đã có tác động gây độc trên chuột.
3. 3. Kết quả khảo sát tác dụng dược lý
3.3.1. Kết quả khảo sát tác dụng kháng ung thư in vitro
3.3.1.1. Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào Hep G2
Hep G2 là dòng tế bào ung thư thương mại được sử dụng phổ biến trên toàn thế
giới. Khi sử dụng nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư in vitro của các hoạt chất hay
thuốc, Hep G2 có một số ưu điểm như dễ nuôi cấy, thích nghi và tăng sinh nhanh, môi trường nuôi đơn giản, phản ứng rõ rệt khi bị tác động bới tác chất nghiên cứu. Bên cạnh đó, Hep G2 cũng là dòng sẵn có và đang được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nên đề tài đã sử dụng dòng này nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí.
Trong quá trình hoạt hóa và nhân sinh khối dòng tế bào, chúng tôi nhận thấy các
tế bào nuôi bình thường khoảng 5 – 7 ngày sẽ phát triển dày đặc bình nuôi cấy, cần
phải cấy chuyền. Do đó, chúng tôi chọn khoảng thời gian khảo sát đường cong tăng trưởng là 10 ngày.
Dịch huyền phù ban đầu cấy vào các giếng khảo sát có nồng độ 2.5x105 tế bào/ml, mỗi giếng được cấy 150µl dịch tế bào.
Sau mỗi 24h, quan sát các giếng dưới kính hiển vi để đánh giá mức độ phát triển
tế bào. Tất cả những giếng bị nhiễm hoặc tế bào bị chết sẽ bị loại bỏ. Nếu số giếng bị
loại bỏ >10%, làm lại lô thí nghiệm.
Thực hiện 10 giếng cho mỗi ngày khảo sát.
Tất cả các kết quả được đánh giá thống kê ở mức ý nghĩa α = 0.01 (độ tin cậy
99%).
(a)
(c)
Hình 3.2: Hình ảnh tế bào Hep G2 được khảo sát đường cong tăng trưởng
(a)Các tế bào sau 24h (b)Các tế bào sau 48h (c)Các tế bào sau 6 ngày
Bảng 3.2. Mật độ tế bào Hep G2 khi khảo sát đường cong tăng trưởng
Ngày khảo sát Mật độ tế bào (x104/ml) Ngày khảo sát Mật độ tế bào (x104/ml) 0 25 6 235.09 ± 5.92 1 29.89 ± 2.57 7 260 ± 5.59 2 37.89 ± 4.28 8 256.38 ± 3.71
3 65.07 ± 7.68 9 257.07 ± 3.82
4 134.64 ± 6.09 10 253.91 ± 2.74
5 169.76 ± 5.92
α = 0.01
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn đường cong tăng trưởng của tế bào Hep G2
Từ kết quả khảo sát, ta thấy thời gian để tế bào ổn định là khoảng 2 ngày. Sự khác (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biệt về mật độ tế bào của ngày 2 và ngày 0 là không có ý nghĩa thống kê. Sau 2 ngày, quần thể tế bào bắt đầu đi vào pha tăng trưởng.
Quần thể tế bào phát triển đến khoảng 6 ngày sau khi cấy thì mật độ có tăng nhưng chậm lại và đi vào pha ổn định. Nếu tiếp tục nuôi, tế bào bong ra và chết, mật độ
0 50 100 150 200 250 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ngày khảo sát M ậ t đ ộ t ế b à o ( x 1 0 4 )
giảm dần. Nguyên nhân do tế bào đã mọc dày trong giếng nuôi nên không còn chỗ để
bám, ức chế lẫn nhau.
Đường cong tăng trưởng này là cơ sở để chúng tôi chọn thời điểm bắt đầu khảo
sát. Theo kết quả có được từ khảo sát đường cong tăng trưởng, chúng tôi quyết định
chọn thời điểm bắt đầu khảo sát tác động của sản phẩm là 2 ngày sau khi cấy tế bào vào giếng.
Phương pháp trypan blue được thực hiện trước tiên trong quá trình khảo sát với
mục đích thăm dò tác động của các nồng độ sản phẩm theo thời gian.
Khảo sát được thực hiện trong 5 ngày, tương ứng với thời gian quần thể tế bào
đang trong pha tăng trưởng.
3.3.1.2. Kết quả khảo sát tác dụng kháng ung thư bằng nhuộm trypan blue
Trong quá trình khảo sát, bằng cách theo dõi tế bào trong đĩa nuôi cấy dưới kính