Riêng cao chiết ớt tiến hành dùng máy cô quay ở nhiệt độ 600C, tốc độ quay 110 vòng/phút để thu được cao chiết ớt dưới dạng cao sệt.
Cao chiết thu được, đem sấy trong tủ sấy MEMMERT ở nhiệt độ 600C trong 24 giờđể thu được cao capsaicin dạng đặc quánh (xem hình 2.8).
Hình 2.8. Cao chiết capsaicin – ớt 2.2.1.4. Phương pháp đóng viên
Phối trộn các loại bột cùng với cao chiết thu được ở trên với tá dược – bột sắn dây – theo tỉ lệđã tính toán trước (xem phần 1.1.5).
Hỗn hợp bột sau đó được đổ ra khay và sấy khô ở nhiệt độ 600C bằng tủ sấy,
khoảng 30 phút trộn đều một lần.
Tạo cốm: dùng máy xay trộn hỗn hợp bột đã sấy khô hoàn toàn ở trên chung với chất kết dính Aerosil.
Dập viên nang capsule với lượng 500mg nguyên liệu/1 viên nang.
Hình 2.10. Quá trình dập viên
Tất cả các thao tác trong quá trình đóng viên được thực hiện trong phòng vô trùng, ở nhiệt độ 200C và độ ẩm 30%.
Kiểm tra, đánh giá sản phẩm theo các tiêu chí trong bảng 2.4
Bảng 2.4. Yêu cầu kết quả chỉ tiêu cảm quan đối với sản phẩm [7]
Tên chỉ tiêu Yêu cầu
1. Màu sắc Đặc trưng của từng nguyên liệu
2. Mùi Đặc trưng của từng nguyên liệu, không có mùi lạ
4. Trạng thái Độ ẩm không quá 10%, viên nang khô, bóng,
đều
Sản phẩm được bảo quản trong lọ sạch, kín có chứa các gói hút ẩm và giữ ở
nhiệt độ phòng.
2.2.2. Phương pháp khảo sát độc tính sản phẩm
2.2.2.1. Phương pháp khảo sát độc tố cấp tính
Được tiến hành theo phương pháp “up and down” trong hướng dẫn 425 về khảo sát độc tính hoạt chất tự nhiên của tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD
(Organization for Economic Co-operation and Development), hướng dẫn này cũng
nằm trong tiêu chí đánh giá độc tính hoạt chất tự nhiên của tổ chức sức khỏe thế giới
WHO.
Bước 1: thử nghiệm ở liều đơn 2000 mg/kg
Bố trí thí nghiệm
Dùng 15 con chuột nhắt trắng 2 tuần tuổi cho liều thử nghiệm này, gồm 8 chuột cái và 7 chuột đực.
Phương thức cho uống: sản phẩm được hòa tan trong nước cất, cho chuột uống thông qua một kim hơi cong có đầu tù với liều lượng tương ứng, được cho uống vào 8 giờ sáng mỗi ngày để đảm bảo khi đó dạ dày đã tiêu hóa bớt, giúp hấp thụ sản phẩm tốt hơn, cũng như tránh tình trạng căng quá mức của dạ dày chuột.
Chuột được chăm sóc trong cùng một điều kiện phòng thí nghiệm
Tiến hành quan sát biểu hiện mọi mặt của chuột như ăn uống, đại tiểu tiện, sắc thái, lông, mắt… trong vòng 72 giờ, ghi nhận lại số chuột chết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường hợp 1: dưới 50% chuột chết, suy ra giá trị LD50 thuộc khoảng tiệm cận trên của 2000 mg/kg. Tiến hành thử nghiệm ở liều 2200 mg/kg, 2500 mg/kg, 2800 mg/kg.
Trường hợp 2: trên 50% chuột chết, suy ra giá trị LD50 thuộc khoảng tiệm cận
dưới của 2000 mg/kg. Tiến hành thử nghiệm ở liều 1200 mg/kg, 1500 mg/kg, 1800 mg/kg.
Trường hợp 3: 100% chuột đều sống. Tiến hành bước 2, thử nghiệm ở liều đơn
5000 mg/kg.
Bước 2: Thử nghiệm ở liều đơn 5000 mg/kg
Bố trí thí nghiệm
Tương tự bước 1
Đánh giá kết quả
Trường hợp 4: dưới 50% chuột chết, suy ra giá trị LD50 thuộc khoảng tiệm cận trên của 5000 mg/kg. Tiến hành thử nghiệm ở liều 5200 mg/kg, 5400 mg/kg, 5600 mg/kg.
Trường hợp 5: trên 50% chuột chết, suy ra giá trị LD50 thuộc khoảng tiệm cận
dưới của 2000 mg/kg. Tiến hành thử nghiệm ở liều 4400 mg/kg, 4600 mg/kg, 4800 mg/kg.
Trường hợp 6: 100% chuột đều sống, suy ra sản phẩm không có độc tố cấp
Hình 2.11. Quy trình khảo sát độc tốcấp tính (trên 1 nhóm 5 con) 2.2.2.2. Phương pháp khảo sát độc tính bán trường diễn
Động vật thí nghiệm: 20 con chuột nhắt trắng, cân nặng khoảng 18 – 20g, gồm 10
đực và 10 cái.
Bố trí thí nghiệm
Chuột nhắt trắng được chia làm 4 lô, mỗi lô gồm 5 con chuột. 2000 mg/kg 2500 mg/kg 2800 mg/kg 1200 mg/kg 1500 mg/kg 1800 mg/kg Bước 2 OOOXX OOXXX OXXXX XXXXX OOOOO OOOOX LD50 LD50 Bước 1 OOOOO TH2 TH1 TH3 5000 mg/kg 5400 mg/kg 5600 mg/kg 4400 mg/kg 4600 mg/kg 4800 mg/kg Không có độc tố cấp tính OOOXX OOXXX OXXXX XXXXX OOOOO OOOOX LD50 LD50 Bước 2 OOOOO TH5 TH4 TH6 6 2200 mg/kg 5200 mg/kg O: Sống X: Chết
Lô 1 (lô đối chứng - ĐC): chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/con/ngày.
Lô 2 (lô thí nghiệm – TN1): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 150 mg/kg bwt/con/ ngày.
Lô 3 (lô thí nghiệm – TN2): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 200 mg/kg bwt/con/ngày.
Lô 4 (lô thí nghiệm – TN3): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 250 mg/kg bwt/con/ ngày.
Cho chuột uống sản phẩm liên tục trong 14 ngày, các chuột thí nghiệm được nuôi trong cùng một chế độ, cùng điều kiện phòng thí nghiệm.
Các chuồng được cho ăn cùng một lượng thức ăn 5 g/con/ngày, uống nước đầy đủ.
Đánh giá kết quả
Tiến hành quan sát biểu hiện mọi mặt của chuột như ăn uống, đại tiểu tiện, sắc thái, lông, mắt… trong vòng 72 giờ sau khi ngừng sử dụng sản phẩm, ghi nhận lại số chuột chết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá độc tính của sản phẩm thông qua tỷ lệ chuột chết, tính toán giá trị
LD50 theo phương pháp của Karber.
2.2.3. Phương pháp khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm
2.2.3.1. Phương pháp khảo sát tác dụng kháng ung thư in vitro
a. Phương pháp giải đông, nuôi cấy, nhân dòng tế bào ung thư Hep G2
Chuyển cryotupe chứa tế bào từ bình nitơ lỏng lập tức vào lọ nước ấm 36 - 380C.
Khi dịch tế bào tan hoàn toàn, cho từ từ vào cryotupe khoảng 1ml môi trường
DMEM 10% FBS, huyền phù nhẹ, sau đó chuyển dịch này vào ống falcon, đem đi ly tâm 1500v/p trong 5 phút để loại bỏ DMSO.
Ly tâm xong, nghiêng nhẹ ống falcon đổ bỏ dịch nổi, cho vào ống falcon 2 –
3ml môi trường DMEM 10% FBS sau đó dùng pipetman 1000µl huyền phù nhẹ tế bào trở lại trong môi trường nuôi.
Chuyển dịch huyền phù tế bào vào bình Roux 25ml, thêm từ từ 2ml môi trường nuôi cấy vào bình Roux.
Ủ bình nuôi trong tủ nuôi cấy 370C, 5% CO2, 24h.
Sau 24h, cẩn thận loại bỏ môi trường cũ và thay bằng 4ml môi trường mới.
Dòng tế bào ung thư gan Hep G2 nuôi trong môi trường DMEM F12 10% FBS, 0.1% kháng sinh. Tế bào được giữ trong tủ nuôi 370C, 5% CO2. Thay
môi trường 3 ngày/lần, cấy chuyền tế bào khi tế bào phát triển hơn 80% bề mặt nuôi cấy.
II.3.1.2. Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng của Hep G2
Chọn các bình Roux có mật độ tế bào cao và tách tế bào bằng Trypsin – EDTA 0.25%. Ly tâm và tạo dịch huyền phù tế bào như trong quá trình nhân sinh khối tế bào.
Xác định mật độ tế bào sống trong dịch huyền phù bằng buồng đếm Neubauer
với thuốc nhuộm Trypan Blue.
Điều chỉnh mật độ tế bào của dịch huyền phù về khoảng 105 - 106 tế bào/ml và cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 150µl. Cần đảm bảo huyền
phù thật đều để số lượng tế bào trong các giếng đều nhau. Đặt đĩa vào tủ nuôi
Sau mỗi 24h, tách tế bào trong 10 giếng và xác định mật độ.
Thực hiện khảo sát trong 10 ngày. Ghi nhận số liệu và xác định đường cong tăng trưởng của tế bào.
Đường cong này sẽ là cơ sở để chọn thời điểm bắt đầu khảo sát tác động của
hoạt chất.
b. Khảo sát tác dụng kháng ung thư bằng nhuộm trypan blue
Nguyên tắc: phương pháp này xác định tác động của các hoạt chất thử nghiệm
lên dòng tế bào quan tâm thông qua việc xác định số lượng tế bào còn tồn tại trong
giếng khi có và không có hoạt chất nhờ thuốc nhuộm trypan blue. Nguyên tắc chính
của phương pháp là phân biệt tế bào sống và chết dưới kính hiển vi nhờ sự phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khác biệt đối với thuốc nhuộm. Do trypan blue chỉ có thể đi xuyên qua màng tế bào chết, nên sau khi nhuộm, tế bào sống không bắt màu thuốc nhuộm sẽ nhỏ, tròn và khúc xạ, còn tế bào chết sẽ phồng to lên và có màu xanh đen của trypan blue. Tế bào sau khi
được tách bằng trypsin, sẽ được nhuộm và đếm bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính
hiển vi quang học. Qui trình thực hiện như sau:
Thực hiện tạo dịch huyền phù tế bào có mật độ khoảng 105 – 106 như khi khảo sát đường cong tăng trưởng.
Cấy vào mỗi giếng 150µl dịch huyền phù tế bào, đặt đĩa vào tủ nuôi 370C, 5% CO2 cho các tế bào ổn định.
Sau khi nuôi ổn định 2 ngày, thay môi trường cũ bằng môi trường mới có chứa
sản phẩm theo các nồng độ 0.005, 0.010, 0.015, 0.020, 0.025 mg/ml.
Sau mỗi 24h, 48h, 72h, 96h, 120h khảo sát, tách tế bào trong các giếng tương ứng của thời điểm khảo sát đó bằng trypsin – EDTA 0,25%. Nhuộm tế bào với
thuốc nhuộm trypan blue, và đếm bằng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển
Đếm tất cả các tế bào sống có trong 5 ô lớn của buồng đếm, sau đó lấy trung bình của 5 ô (A). Mỗi giá trị trung bình này được tính cho một lần thí nghiệm, thí nghiệm được lặp lại 15 lần.
Lô đối chứng cũng được thực hiện tương tự với môi trường chứa dung môi hòa tan cao chiết (DMSO).
Số tế bào (N) trong 1ml mẫu (cũng là trong 1 ô lớn):
N = 2 x A x 104
Khả năng giết chết tế bào ung thư của sản phẩmđược tính theo công thức:
H(%) = [(TĐC – TKS)/ TĐC] x 100%
H: tỷ lệ gây chết tế bào ung thư
TĐC: mật độ tế bào của lô đối chứng
TKS: mật độ tế bào của lô khảo sát
c. Khảo sát tác dụng kháng ung thư bằng nhuộm MTT
Nguyên tắc: Phương pháp MTT (Mosmann, 1983) là một phương pháp định lượng theo cách so màu khá nhạy dùng cho việc xác định sự sống, tăng sinh và hoạt động của tế bào. Tế bào sống được trong một môi trường thì sẽ có sự hoạt động của
enzym dehydrogenase ty thể. Enzym này sẽ chuyển cơ chất MTT 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide màu vàng, tan trong nước
thành sản phẩm formazan màu xanh đen, không tan trong nước. Lượng formazan được
tạo thành phản ánh số tế bào sống (Mosmann, 1983, Gerlier và Thomasset, 1986, Gralier và cộng sự, 1988, Al-Rubeai và Spier, 1989). Qui trình thực hiện như sau:
Thực hiện các bước đến khi cấy tế bào vào đĩa 96 giếng giống như trong phương pháp nhuộm trypan blue.
Sau 48h ủ trong tủ nuôi 370C, 5% CO2, thay môi trường cũ bằng môi trường
mới có chứa sản phẩm theo các nồng độ 0.005, 0.010, 0.015, 0.020, 0.025 mg/ml.
Đặt đĩa vào tủ nuôi 370C, 5% CO2.
- Sau mỗi 24h, 48h, 72h khảo sát, thêm 10µl MTT vào mỗi giếng, ủ trong 4h. Sau
đó loại bỏ dịch nổi, rửa lại với DMSO. Đo mật độ quang bằng máy đo ELISA đĩa nhiều giếng ở bước sóng 570nm.
- Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của sản phẩm được tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
theo công thức:
H(%) = [(ODĐC – ODKS)/ ODĐC] x 100%
H: tỷ lệ gây chết tế bào ung thư
ODĐC: OD của lô đối chứng
ODKS: OD của lô khảo sát
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 15 lần. d. Phương pháp phân tích hình thái tế bào
Sau khi ủ với sản phẩm, các tế bào được rữa với PBS lạnh, trãi lên lame kính
và cố định ethanol 70% khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào cố định được rữa với PBS lạnh, nhuộm với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin, quan sát dưới kính hiển vi
(400x). Các tế bào apoptotic được nhận diện bằng những đặc điểm hình thái đặc trưng
(tế bào co lại, nhiễm sắc thể cô đặc, xuất hiện các bóng màng và sự hình thành các thể
apoptotic).
2.2.3.2. Phương pháp khảo sát tác dụng tăng cường sức khỏe
Bố trí thí nghiệm
Chuột được chia làm 3 lô, mỗi lô gồm 5 con.
Lô 1 (lô đối chứng – ĐC: chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/con/ngày.
Lô 2 (lô thí nghiệm – TN1): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 150 mg/kg bwt/ngày.
Lô 3 (lô thí nghiệm – TN2): chuột được cho uống sản phẩm ở liều 200 mg/kg bwt/ngày.
Chuột được uống sản phẩm liên tục trong 14 ngày.
Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả bằng mô hình chuột bơi kiệt sức: sử dụng bể chứa nước cao
20cm (mực nước 15cm), cột vào đuôi chuột miếng kim loại nặng 6g, thả chuột vào bể nước, đo thời gian từ thời điểm thả vào đến khi chuột không thể đưa mũi lên khỏi mặt nước.
Khảo sát thời gian bơi của chuột vào các ngày 0, ngày 7 (trước khi dùng sản phẩm) và ngày 14 (sau khi kết thúc dùng sản phẩm).
Đánh giá tác dụng tăng cường sức khỏe bằng cách so sánh thời gian bơi của
chuột trước và sau khi dùng sản phẩm ở lô thí nghiệm và lô đối chứng. 2.2.3.3. Phương pháp khảo sát tác dụng kháng viêm
Động vật thí nghiệm: 15 chuột nhắt trắng đực, cân nặng khoảng 28 – 30g.
Tạo mô hình chuột viêm đùi sau bằng phương pháp tiêm formol 2% vào cơ đùi liều đơn 0,1 ml/chuột.
Bố trí thí nghiệm
15 chuột nhắt trắng đực đã gây viêm, chia làm 3 lô thí nghiệm, mỗi lô gồm 5 con chuột.
Lô 1 (đối chứng âm – ĐC (–)): chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/con/ngày trong 5 ngày.
Lô 2 (đối chứng dương – ĐC (+)): chuột được cho uống Alpha chemotrypsin với liều 50 mg/kg/ngày trong 5 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô 3 (lô thí nghiệm – TN): chuột được cho uống sản phẩm ở nồng độ 200 mg/kg/ngày trong 5 ngày.
Đánh giá kết quả
Xác định thể tích đùi sau của chuột bằng phương pháp đo trực tiếp dùng dây và thước vạch 1mm.
Khảo sát liên tục 1 lần/ngày trong 5 ngày, sau 5 ngày, chỉ quan sát và tính thời điểm chuột lành hẳn ở các lô (hết viêm và đi bình thường).
Xác định thể tích V0 của chân chuột trước khi gây viêm bằng formol.
Xác định thể tích chân chuột V1, V2, V3, V4, V5 tại các ngày 1, 2, 3, 4 và 5 sau khi gây viêm.
Xác định tỉ lệ phù chân theo công thức % = x 100%
Trong đó: X là tỷ lệ phù chân chuột
Vt là thể tích chân chuột ở thời điểm t sau khi gây viêm Vo là thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
Tác dụng kháng viêm của sản phẩm được đánh giá bằng cách so sánh tỷ lệ phù chân giữa các lô chuột.
2.2.3.4. Phương pháp khảo sát tác dụng giảm đau
Động vật thí nghiệm: 15 chuột nhắt trắng cái, cân nặng khoảng 25g.
Tạo mô hình chuột gây đau nội tại bằng acid acetic: tiêm acid acetic 1% vào
màng bùng chuột với liều đơn 0.2 ml/chuột. Bố trí thí nghiệm
Lô 1 – đối chứng âm (ĐC –): chuột được cho uống nước cất liều 0.2 ml/chuột.
Lô 2 – đối chứng dương (ĐC +): chuột được cho uống aspirin với liều 50 mg/kg.
Lô 3 – thí nghiệm (TN): chuột được cho uống sản phẩm với liều 250 mg/kg.
Đánh giá kết quả
Quan sát biểu hiện đau của chuột thông qua sự đau quặn ở bụng (co thắt bụng,
duỗi thẳng ít nhất một chân sau).
Tính thời giantừ khi gây đau đến khi xuất hiện lần đau quặn đầu tiên.
Đếm số lần đau quặn của chuột trong 5 phút, kể từ khi xuất hiện cơn đau đầu
tiên.
Đánh giá tác dụng giảm đau của sản phẩm bằng cách so sánh số lần đau quặn