a. Phương pháp giải đông, nuôi cấy, nhân dòng tế bào ung thư Hep G2
Chuyển cryotupe chứa tế bào từ bình nitơ lỏng lập tức vào lọ nước ấm 36 - 380C.
Khi dịch tế bào tan hoàn toàn, cho từ từ vào cryotupe khoảng 1ml môi trường
DMEM 10% FBS, huyền phù nhẹ, sau đó chuyển dịch này vào ống falcon, đem đi ly tâm 1500v/p trong 5 phút để loại bỏ DMSO.
Ly tâm xong, nghiêng nhẹ ống falcon đổ bỏ dịch nổi, cho vào ống falcon 2 –
3ml môi trường DMEM 10% FBS sau đó dùng pipetman 1000µl huyền phù nhẹ tế bào trở lại trong môi trường nuôi.
Chuyển dịch huyền phù tế bào vào bình Roux 25ml, thêm từ từ 2ml môi trường nuôi cấy vào bình Roux.
Ủ bình nuôi trong tủ nuôi cấy 370C, 5% CO2, 24h.
Sau 24h, cẩn thận loại bỏ môi trường cũ và thay bằng 4ml môi trường mới.
Dòng tế bào ung thư gan Hep G2 nuôi trong môi trường DMEM F12 10% FBS, 0.1% kháng sinh. Tế bào được giữ trong tủ nuôi 370C, 5% CO2. Thay
môi trường 3 ngày/lần, cấy chuyền tế bào khi tế bào phát triển hơn 80% bề mặt nuôi cấy.
II.3.1.2. Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng của Hep G2
Chọn các bình Roux có mật độ tế bào cao và tách tế bào bằng Trypsin – EDTA 0.25%. Ly tâm và tạo dịch huyền phù tế bào như trong quá trình nhân sinh khối tế bào.
Xác định mật độ tế bào sống trong dịch huyền phù bằng buồng đếm Neubauer
với thuốc nhuộm Trypan Blue.
Điều chỉnh mật độ tế bào của dịch huyền phù về khoảng 105 - 106 tế bào/ml và cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 150µl. Cần đảm bảo huyền
phù thật đều để số lượng tế bào trong các giếng đều nhau. Đặt đĩa vào tủ nuôi
Sau mỗi 24h, tách tế bào trong 10 giếng và xác định mật độ.
Thực hiện khảo sát trong 10 ngày. Ghi nhận số liệu và xác định đường cong tăng trưởng của tế bào.
Đường cong này sẽ là cơ sở để chọn thời điểm bắt đầu khảo sát tác động của
hoạt chất.