TRUNG MÔ NUÔI CẤY THEO HƢỚNG TẠO TẾ BÀO CƠ TIM
Sau khi khẳng định tập hợp tế bào thu được sau các quy trình phân lập và nuôi cấy ngoài cơ thể là MSC theo các tiêu chuẩn hình thái tế bào, marker bề mặt và khả năng biệt hóa tạo tế bào mỡ được trình bày ở trên, tiến hành nghiên
cứu biệt hóa in vitro các tế bào này theo hướng tạo các tế bào cơ tim. Đánh giá
biến đổi của MSC sau khi áp dụng quy trình của Tomita và cs dựa trên: - Hình thái vi thể, siêu vi thể tế bào.
- Biểu hiện protein khung bào tương đặc trưng cho dòng tế bào cơ: Desmin. - Biểu hiện và mức độ biểu hiện một số gen đặc trưng cho quá trình biệt hóa tế bào cơ, cơ tim: họ MEF2, GATA4, Nkx2.5/Csx.
Biệt hóa MSC theo hướng cơ tim áp dụng quy trình biệt hóa của Shim và cs được bước đầu nghiên cứu thử nghiệm và chỉ đánh giá mức độ biểu hiện một số gen đặc trưng.
3.2.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Tomita và cs
3.2.1.1. Hình thái vi thể và siêu vi thể tế bào
Hình thái vi thể
Theo dõi sự biến đổi hình thái vi thể tế bào sau biệt hóa dưới KHV quang học đối pha trong suốt quá trình từ sau khi gây biệt hóa đến khi kết thúc biệt hóa (4 tuần).Trong thời gian biệt hóa theo hướng hình thành tế bào cơ tim, các tế bào nuôi cấy không có hiện tượng tăng sinh, làm cho mật độ tế bào không tăng lên mà có xu hướng giảm đi. Bên cạnh đó có hiện tượng thay đổi hình thái tế bào bám bề mặt nhựa nuôi cấy: các tế bào trải rộng, tăng sinh các nhánh bào tương (Hình 3.15).
Hình 3.14. Tế bào gốc trung mô không định hướng biệt hóa (KHV đối pha x200).
Các tế bào trong môi trường nuôi cấy thông thường không định hướng biệt hóa có dạng hình sợi, kích thước to nhỏ không đồng đều, có hướng nằm song song với nhau.
- Ranh giới giữa bào tương và bề mặt nhựa nuôi cấy rõ nét. - Mật độ tế bào dày, các tế bào sát nằm cạnh nhau.
Hình 3.15. Tế bào gốc trung mô sau 4 tuần biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs (KHV đối pha x200).
Các tế bào trong môi trường nuôi cấy biệt hóa phát triển trên bề mặt nuôi cấy không đồng đều về mặt kích thước. Tế bào có bào tương lớn, phân thành nhiều nhánh tỏa theo các hướng khác nhau, ranh giới bào tương và bề mặt nhựa nuôi cấy khó phân biệt. Mật độ tế bào giảm đi so với mẫu chứng không định
Hình thái siêu vi thể
+ Tế bào gốc trung mô không định hướng biệt hóa thành tế bào dạng tế bào cơ tim:
Dưới KHV điện tử truyền qua, trong bào tương tế bào có lưới nội bào khá phát triển. Nhân tế bào chiếm diện tích lớn, ranh giới dịch nhân và chất nhân rõ rệt. Không thể hiện các cấu trúc khác đặc trưng cho tế bào cơ tim, như các vi xơ (Hình 3.16).
Hình 3.16. Siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô không định hướng biệt hóa. 1- Lưới nội bào; 2 - Màng nhân;
3 - Hạt nhân; 4 - Chất nhân (TEM x2 500).
2
4 3
2
+ Tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy biệt hóa theo hướng thành tế bào cơ tim:
Dưới KHV điện tử truyền qua thấy rõ trong bào tương các tế bào biệt hóa bằng 5 – azacytidin các bó xơ có mật độ điện tử cao. Các bó xơ này gồm các xơ có kích thước đồng đều, nằm song song với nhau theo kiểu so le và song song với chiều dài tế bào, khoảng cách giữa các xơ này tương đối đều. Các bó xơ này có độ dài ngắn khác nhau và không tạo hình ảnh các vân ngang (Hình 3.17).
Hình 3. 17. Siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô sau 4 tuần biệt hóa theo hướng hình thành tế bào cơ tim, theo phương pháp của Tomita
và cs. 1 – Các bó xơ; 2 – Không bào vi ẩm; 3 – Màng ngoài tế bào (TEM x15 000).
3
1 1
Trong bào tương của phần lớn các MSC biệt hóa phát hiện thấy các xơ có đậm độ điện tử tương đối cao, xếp song song với nhau, đường kính xấp xỉ 10 nm, tương đương kích thước của xơ trung gian thuộc cấu trúc khung tế bào. Các xơ này nằm tập trung thành đám, gần màng tế bào và lan tỏa vào phía trung tâm, xen kẽ vào giữa các bào quan. Lưới nội bào không hạt khá phát triển (Hình 3.18 A và B)
Hình 3.18. Siêu cấu trúc tế bào gốc trung mô sau 4 tuần biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs. 1 – Xơ trung gian; 2 – Màng tế bào;
3- Lưới nội bào (TEM - Hình A x25 000; Hình B x15 000).
1 1 A 1 B 2 2 3
3.2.1.2. Kết quả xác định protein bào tương tế bào sau biệt hóa
Kết quả phân tích hình thái siêu vi thể xác định: trong bào tương các MSC biệt hóa theo hướng hình thành tế bào cơ tim bằng 5 – azacytidine, sau 4 tuần, xuất hiện nhiều xơ trung gian, kích thước khoảng 10 nm. Để xác định các xơ này có thuộc loại protein đặc hiệu cho khung tế bào cơ, cơ tim – Desmin hay không sử dụng phương pháp ICC với kháng thể chuột đơn dòng và phương pháp nhuộm enzyme peroxidase. Kết quả cho thấy các tế bào sau biệt hóa biểu hiện dương tính với kháng thể kháng Desmin ở các mức độ khác nhau (Hình 3.19).
Hình 3.19. Nhuộm kháng thể kháng Desmin tế bào gốc trung mô sau 4 tuần biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs. : dương tính với
kháng thể kháng Desmin (ICC x400), (các kết quả phân tích được lặp lại 3 lần).
Các tế bào được phân bố khá đều đặn. Những tế bào này có hình thái đa dạng, một số tế bào có hình tròn, một số có hình thoi hay hình lá. Nhân của một số tế bào nằm sát màng. Bào tương có biểu hiện dương tính dạng hạt với kháng
thể kháng Desmin (bắt màu nâu vàng) với mật độ bắt màu từ thưa thớt đến dày đặc.
3.2.1.3. Kết quả biểu hiện gen một số yếu tố phiên mã đặc trưng cho tế bào cơ tim của tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy biệt hóa thành dạng tế bào cơ tim
Thu hoạch MSC nuôi cấy biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs tại các thời điểm 7, 14, 21 28 ngày, xác định biểu hiện mức độ mRNA các yếu tố phiên mã họ MEF (2A, 2C, 2D), GATA4, Nkx2.5/Csx. Sử dụng kỹ thuật định tính, bán định lượng RT – PCR và kỹ thuật Real-time PCR để phân tích đánh giá. Sử dụng gen nội chuẩn cho kỹ thuật RT – PCR là GAPDH, gen tham chiếu
cho kỹ thuật Real - time PCR là - actin.
Kết quả phân tích biểu hiện gen họ MEF2, GATA4, Nkx2.5/Csx
Hình 3.20. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện một số gen
đặc trưng tế bào cơ tim của tế bào gốc trung mô sau 4 tuần biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs (các kết quả phân tích được lặp lại 3 lần).
MSC biệt hóa sau 4 tuần có biểu hiện dương tính với 4 trên tổng số 5 marker đặc trưng quá trình biệt hóa tế bào cơ tim. Các marker có biểu hiện dương tính là GATA4 (347bp) và họ MEF2, bao gồm: MEF2A (247bp), MEF2C (230bp), MEF2D (253bp). Trong đó, mức độ biểu hiện của các yếu tố tăng cường phiên mã họ MEF2 cao hơn hẳn so với GATA4. Ngược lại, sau cùng một thời gian biệt hóa các MSC biểu hiện âm tính với Nkx2.5/Csx (262bp). GAPDH được sử dụng làm gen nội chuẩn, biểu hiện dương tính ở tất cả các mẫu phân tích. MEF 2C 2A 2D M GATA4 Nkx2.5/Csx M GAPDH 350 bp 350 bp 347 bp 230 bp 300 bp 200 bp 400 bp 300 bp
Kết quả phân tích biểu hiện gen MEF2C
Hình 3.21. Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR biểu hiện gen MEF2C
của tế bào gốc trung mô sau 2 - 3 tuần biệt hóa
theo phương pháp của Tomita và cs (các kết quả phân tích được lặp lại 3 lần).
MEF2C có biểu hiện ở mẫu không định hướng biệt hóa và tăng cường mức độ biểu hiện ở các mẫu sau biệt hóa 2 – 3 tuần.
GAPDH được sử dụng làm gen nội chuẩn, biểu hiện dương tính đồng đều ở tất cả các mẫu phân tích.
Họ MEF2C biểu hiện ở cả mẫu MSC không định hướng biệt hóa và mẫu biệt hóa, do vậy sử dụng phương pháp định lượng Real - time PCR để xác định mức độ biểu hiện gen của MEF2C trên các mẫu MSC biệt hóa so sánh với các
mẫu MSC không định hướng biệt hóa, sử dụng gen - actin làm gen tham
chiếu. Kết quả cho thấy các mẫu MSC sau biệt hóa 2 – 4 tuần có biểu hiện gen MEF2C cao hơn rõ rệt so với mẫu không định hướng biệt hóa (Hình 3.22). Phân
tích đồng thời biểu hiện gen tham chiếu - actin bằng Real – time PCR ở các
mẫu tế bào tương ứng (Hình 3.23). Từ kết quả chu kỳ ngưỡng của gen MEF2C
và - actin xác định được mức độ biểu hiện MEF2C của mẫu sau biệt hóa 2 – 4
tuần (Bảng 3.5).
300 bp 200 bp
230 bp
GAPDH 350 bp
Sau biệt hóa Không bh M
Hình 3.22. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen MEF2C của tế bào gốc trung
mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 4 tuần, theo phương pháp của
Tomita và cs. A: Đồ thị tín hiệu huỳnh quang, B: Đồ thị đường cong nóng chảy. A: Đồ thị tín hiệu huỳnh quang cho thấy: các mẫu MSC sau biệt hóa (1,2,3,4) có
chu kỳ ngưỡng của MEF2C (từ CT 19 ÷ CT21) thấp hơn so với chu kỳ ngưỡng
của các mẫu không định hướng biệt hóa (5,6,7,8) (từ CT
26 ÷ CT29). Mẫu chứng
âm (9) không có chu kỳ ngưỡng.
1,2,3,4 5,6,7,8 9 1,2,3,4, 5,6,7,8 B A
B: Đồ thị đường cong nóng chảy cho thấy cho thấy tất cả các các mẫu đều chỉ ở
một đỉnh duy nhất với nhiệt độ nóng chảy là 76,40C. Như vậy kết quả của phản
ứng Real-time PCR thu được là đặc hiệu và có độ tin cậy.
Hình 3.23. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen - actin của tế bào gốc trung
mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 4 tuần, theo phương pháp của
Tomita và cs. A: Đồ thị tín hiệu huỳnh quang, B: Đồ thị đường cong nóng chảy. 1,2,3,4 ,5,6,7,8 1,2,3,4, 5,6,7,8 A B
A: Đồ thị tín hiệu huỳnh quang cho thấy mẫu MSC sau biệt hóa (1,2,3,4) và không định hướng biệt hóa (5,6,7,8) không có sự khác biệt rõ về chu kỳ ngưỡng
của gen - actin . Chu kỳ ngưỡng dao động trong vùng từ CT 8 đến - CT 13.
B: Đồ thị phân tích đường cong nóng chảy cho thấy: tất cả các mẫu phân tích
đều chỉ có một đỉnh duy nhất và có nhiệt độ nóng chảy là 83,60C. Như vậy sản
phẩm phản ứng Real - time PCR thu được là đặc hiệu và có độ tin cậy.
Bảng 3.5. Kết quả so sánh mức độ biểu hiện của gen MEF2C giữa MSC không định hướng biệt hóa và MSC biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs sau 2
– 4 tuần, sử dụng gen tham chiếu là -actin (n=4).
Mẫu C T -actin C T MEF2 ∆ CT X SD Tỷ lệ biểu hiện 2 - ∆∆CT Không đ.h biệt hóa Số 1 13.25 26.34 13.09 15.23 2.40 2 4.22 2 2.4 18.66 5.28 (lần) Số 2 12.79 26.53 13.74 Số 3 10.12 28.55 18.43 Số 4 13.47 29.12 15.65 Sau biệt hóa Số 1 10.10 19.13 9.03 11.01 1.45 Số 2 8.26 19.39 11.13 Số 3 9.0 21.52 12.52 Số 4 10.52 21.86 11.34
Kết quả bảng 3.5 cho thấy các mẫu MSC sau biệt hóa 2 4 tuần tăng cường
mức độ biểu hiện gen MEF2C so với mẫu MSC không định hướng biệt hóa, cao
3.3.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Shim và cs
Quy trình biệt hóa của Shim và cs sử dụng một loạt các tác nhân biệt hóa được áp dụng trên MSC cấy chuyển ở giai đoạn P3. Biểu hiện gen của 5 yếu tố phiên mã đặc trưng cho quá trình biệt hóa tế bào cơ tim tiếp tục được xác định ở các mẫu MSC sau biệt hóa và mẫu không định hướng biệt hóa.
Hình 3.24. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR
biểu hiện các gen đặc trưng biệt hóa tế bào cơ tim của MSC biệt hóa 7 ngày
theo phương pháp của Shim và cs.M: thang DNA chuẩn; 1: mẫu không định
hướng biệt hóa; 2: mẫu biệt hóa, (các kết quả phân tích được lặp lại 3 lần).
Nhận xét:
A: Biểu hiện các gen đặc trưng biệt hóa tế bào cơ tim: Mẫu MSC không định hướng biệt hóa: có sự biểu hiện gen họ MEF2 -A, - C và – D, biểu hiện không rõ ràng GATA - 4 và không biểu hiện Nkx2.5/Csx. Mẫu MSC sau biệt hóa 7 ngày: tăng cường biểu hiện gen họ MEF2 - A, - C và – D, tăng biểu hiện gen GATA4 so với mẫu không định hướng biệt hóa, không biểu hiện gen Nkx2.5/Csx.
B: GAPDH được sử dụng là gen nội chuẩn, biểu hiện ở tất cả các mẫu phân tích.
GATA4 MEF2A MEF2C MEF2D Nkx2.5/ Csx M
2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 300 bp 200 bp 350 bp GAPDH A B
CHƢƠNG IV
BÀN LUẬN
Sự có mặt trong tủy xương một loại tế bào không thuộc các dòng tế bào máu đã được biết đến từ rất lâu. Tuy nhiên phải từ cuối những năm 60 và đầu những năm 70 của thế kỉ XX thì những nghiên cứu về tế bào đệm của tủy (marrow stromal cells), sau này được gọi bằng nhiều tên gọi khác nhau: tế bào tiền thân trung mô (mesenchymal progenitor cells), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) mới thực sự thu hút được sự quan tâm của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Người ta đã tiến hành nuôi cấy tập hợp tế
bào có dạng hình sợi – tập hợp CFU-f (colony - forming unit - fibroblastic), bắt
nguồn từ tủy xương, có khả năng hình thành tạo cốt bào [44]. Cho tới nay, ngoài tủy xương người ta có thể phân lập MSC từ nhiều mô biệt hóa trong cơ thể
[18],[36]. MSC là tế bào gốc có khả năng đa biệt hóa in vitro, hình thành nhiều
loại tế bào khác nhau, bao gồm: tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào cơ tim, tế bào cơ xương, tế bào thần kinh, tế bào thuộc mô liên kết .v.v.. [27].
Hơn 10 năm gần đây, hàng loạt các nghiên cứu cơ bản về MSC cùng với đó là các thử nghiệm lâm sàng nhắm tới mục tiêu tái tạo một số mô bị tổn thương, mất chức năng nhưng hạn chế về khả năng tự sửa chữa (như mô thần kinh, mô cơ tim) đã và đang được thực hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới [8]. Những nghiên cứu cơ bản cung cấp khá đầy đủ các đặc điểm về kiểu hình – marker bề mặt, đặc điểm miễn dịch, khả năng biệt hóa ngoài cơ thể của MSC. Đồng thời, các thử nghiệm liệu pháp tế bào gốc điều trị một số bệnh lý trong đó có bệnh tim mạch được chứng minh có độ an toàn cao, tuy nhiên mức độ tái tạo – phục hồi mô cơ tim của các liệu pháp này vẫn còn chưa được như mong đợi.
Đề tài được thực hiện trong điều kiện các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng tế bào gốc nói chung và MSC nói riêng bắt đầu nhận được sự quan tâm và hỗ trợ nghiên cứu của Nhà nước. Đề tài “Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị các bệnh về giác mạc và tim mạch” – KC04 -10, được thực hiện lần đầu tiên tại Việt
Nam, do trường Đại học Y Hà Nội chủ trì. Đây là một trong những nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng quan trọng nhằm tiếp cận những vấn đề khoa học và công nghệ tiên tiến về tế bào gốc trên thế giới, từng bước ứng dụng vào điều kiện thực tế ở Việt Nam. Đề tài đã đưa ra những bằng chứng khoa học về khả năng biệt hóa của MSC sau phân lập và nuôi cấy, góp phần làm sáng tỏ tác dụng điều trị khi sử dụng tế bào gốc trong các trường hợp suy tim do NMCT được thực hiện lần đầu tiên tại Việt Nam.
PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, ĐỊNH DANH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƢƠNG NGƢỜI