Nghiên cứu khả năng biệt hóa in vitro của MSC được tiến hành từ rất sớm.
Bắt đầu là các nghiên cứu về khả năng biệt hóa tạo các loại tế bào thuộc tập hợp tế bào đệm tủy xương (tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn). Sự hình thành các tế bào này được cho là do quá trình biệt hóa của MSC trong tủy xương [48]. Sau đó là hàng loạt những nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng tạo ra các loại tế bào có cùng nguồn gốc hay khác nguồn gốc phôi thai như: tế bào cơ, tế bào cơ tim, tế bào thuộc hệ thần kinh, tế bào gan, tế bào tụy [48]. Các nghiên cứu này nhắm tới việc sử dụng liệu pháp tế bào trong việc tái tạo, phục hồi các mô khi
cần thiết. Khả năng biệt hóa in vitro tạo ra 3 loại tế bào nêu trên (tạo cốt bào, tế
bào mỡ, tế bào sụn) được ISCT chọn là một trong ba tiêu chuẩn tối thiểu để khẳng định tập hợp tế bào thu được sau phân lập, nuôi cấy từ nhiều nguồn là tập hợp MSC [38].
1.2.3.1. Biệt hóa tạo tạo cốt bào
Tác nhân gây biệt hóa: Các nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng hình thành các tế bào khoáng hóa sử dụng nhiều loại tác nhân như BMP (bone morphogenetic protein), dexamethasone, 1,25 dihydroxy vitamin D3, acid
ascorbic và -glycerophosphate [34],[94]. Các tác nhân này gắn với các thụ thể
tương ứng như: dexamethasone gắn với thụ thể của glucocorticoid, 1,25 dihydroxy vitamin D3 gắn với thụ thể của vitamin D. Quá trình đáp ứng hình thành tạo cốt bào của MSC tăng lên khi bổ sung các loại BMP vào môi trường nuôi cấy.
Kết quả biệt hóa
Các tế bào xuất hiện tượng tạo khoáng trong bào tương sau 14 21 ngày
biệt hóa. Phương pháp nhuộm hóa tế bào Alizarin đỏ hoặc von - Kossa xác định có hay không sự lắng đọng calcium phosphate trong tế bào. Ngoài ra có thể xác định kết quả biệt hóa tạo tạo cốt bào bằng cách phân tích sự biểu hiện một số protein đặc trưng khác, như: osteocalcin – một protein không thuộc collagen, được tiết ra bởi tạo cốt bào và có liên quan đến mạng lưới khoáng hóa của mô xương; hay sự biểu hiện của yếu tố phiên mã của tạo cốt bào Cbfa1 (core binding factor alpha1) [39].
Hình 1.4. Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mô sau biệt hóa thành tạo cốt bào (C) và không định hướng biệt hóa (D) [37]
Một giả thuyết được đưa ra là quá trình tạo mỡ và xương của MSC có mối liên quan thuận nghịch, do các tác nhân sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo tế bào mỡ cũng được sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo xương và ngược lại [40],[50].
1.2.3.2. Biệt hóa tạo tế bào mỡ
Tác nhân gây biệt hóa : MSC biệt hóa hình thành các tế bào mỡ khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy hỗn hợp dexamethason, indomethacin, insulin, isobutylmethylxanthin, thiazolidinedion [34],[51].
Tác dụng phổ biến của các tác nhân biệt hóa là làm tăng cAMP trong bào tương do ức chế hoạt tính của enzym phosphodiesterase như : isobutylmethylxanthin. Các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy là các ligand của các thụ thể màng nhân như : dexamethason của thụ thể
glucocorticoid; rosiglitazon của PPAR (peroxisome proliferator-activated
receptor ).
Kết quả biệt hóa
MSC thay đổi hình dạng tế bào từ dạng hình sợi sang dạng hình ovan, có chứa các giọt mỡ trong bào tương sau từ 3 ÷ 9 ngày biệt hóa. Các hạt mỡ có thể quan sát trực tiếp dưới KHV quang học đối pha do chúng có độ chiết quang khác với độ chiết quang của nước.
Hình 1.5. Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa
thành tế bào mỡ (E) và không định hướng biệt hóa (F) [37]
Các hạt mỡ được hình thành bắt màu thuốc nhuộm chuyên biệt (Oil - Red O), quan sát được dưới KHV quang học. Ngoài ra có thể xác định biểu hiện các marker về gen của tế bào mỡ trưởng thành như: Protein gắn với acid béo 4 (fatty acid-binding protein 4), lipoprotein lipase; các adipokin (adiponectin, leptin) và các tế bào mỡ này bị phân giải lipid bởi các chất chủ vận adrenergic (adrenergic agonist) [34],[49],[111].
1.2.3.3. Biệt hóa tạo tế bào sụn
Tác nhân biệt hóa: Các tác nhân gây biệt hóa MSC hình thành tế bào sụn bao gồm: ascorbate, BMP 6 (bone morphogenetic protein 6), dexamethason,
TGF-β (transforming growth factor β) [64],[78]. Ngoài việc sử dụng các tác
nhân bổ sung vào môi trường nuôi cấy vừa nêu trên, quá trình biệt hóa MSC theo hướng tạo tế bào sụn cần được tiến hành trong điều kiện nuôi cấy không gian ba chiều. Đây là điều kiện nuôi cấy khác biệt so với nuôi cấy tế bào bám dính đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy tương ứng với điều kiện nuôi cấy không gian hai chiều. Theo cách này, môi trường nuôi cấy chứa các hạt vi khối lượng hoặc nuôi cấy trong mạng lưới như agarose hoặc alginate.
Kết quả biệt hóa
MSC sau biệt hóa biểu hiện các protein đặc trưng cho tổ chức sụn: Collagen typ II, Collagen typ X, Aggrecan.
Hình 1.6. Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mô sau biệt hóa thành tế bào sụn (G) và không định hướng biệt hóa (H) [37]
1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của một tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy
Nhiều cố gắng tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm kiểu hình của MSC đã được tiến hành, nhưng cho đến nay người ta vẫn chưa xác được marker bề mặt duy nhất của MSC. Điều này gây khó khăn cho việc phân lập, chọn lọc cũng
như đánh giá quần thể MSC một cách chính xác. Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (ISCT) đã đưa ra các tiêu chuẩn tối thiểu nhằm xác định một quần thể MSC sau phân lập, nuôi cấy [38], theo đó:
MSC phải bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy tiêu
chuẩn.
MSC biểu hiện dương tính với CD105, CD73 và CD90; biểu hiện âm tính với
CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79 hoặc CD19 và HLA-DR.
MSC có khả năng biệt hóa in vitro thành tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn.
Tiêu chuẩn này nhằm thống nhất các kết quả nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thể giới. Các công bố nghiên cứu về việc phân lập MSC từ các mô trưởng thành, về đặc tính cũng như khả năng ứng dụng của MSC cần tuân thủ những tiêu chuẩn tối thiểu nêu trên của ISCT.
1.2.5. Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô
Các bằng chứng in vivo và in vitro cho thấy MSC là loại tế bào gốc có tiềm
năng nhất so với các loại tế bào gốc và tế bào tiền thân khác đã được nghiên cứu với mục đích sửa chữa tái tạo mô cơ tim trong điều trị các bệnh tim mạch nói chung và NMCT nói riêng.
MSC có nhiều đặc tính nổi trội với vai trò ứng cử viên cho liệu pháp cấy
ghép tế bào, bao gồm: i) dễ dàng nuôi cấy đạt số lượng lớn; ii) có tiềm năng sửa
chữa thành mạch cũng như cơ tim; iii) có các thuộc tính điều hòa miễn dịch và
khả năng ứng dụng trong điều trị đồng loại (allogenetic). Những đặc tính này là
kết quả thu được từ các nghiên cứu cơ bản cũng như những ứng dụng điều trị tim mạch.
1.2.5.1. Sự biểu hiện các marker đặc hiệu cơ tim
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh MSC có được kiểu hình của tế bào cơ tim
khi biệt hóa in vitro (bằng 5-azacytidin) và in vivo (trong mô hình chuột bị gây
NMCT) [122]. Ngoài ra, một số phương pháp biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế
Các marker đặc hiệu tế bào cơ tim như: yếu tố phiên mã đặc hiệu tim (Nkx2.5, GATA4) và các protein thuộc đơn vị co cơ (sacomeres) như: myosin chuỗi nặng của tim (cardiac myosin heavy chain - MHC), α-sarcomeric actinin, cTnT (cardiac troponin T) biểu hiện ở MSC khi đồng nuôi cấy với tế bào cơ tim trưởng thành [8],[133],[136]. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh khả năng MSC biểu hiện kiểu hình của tế bào cơ tim trong mô cơ tim khỏe mạnh cũng như mô cơ tim bị nhồi máu [112],[122].
Không chỉ biểu hiện các protein co cơ, MSC trong điều kiện nuôi cấy giọt treo, sau đó là nuôi cấy trong mạng lưới ngoại bào (extracellular matrix - ECM) đã được chứng minh là có khả năng hình thành các protein đặc hiệu khác của tế bào cơ tim như: α1c - các tiểu đơn vị α của kênh canxi loại L đặc hiệu tim (cardiac-specific L-type calcium channel), Kv4.3 – kênh vận chuyển kali ra ngoài (transient outward potassium channel) và ANP [138],[96].
1.2.5.2. Sự kết nối tế bào – tế bào thông qua các mối liên kết khe (gap junctions)
Khả năng liên kết của MSC với các tế bào cơ tim tại chỗ được chứng minh khi các MSC này biểu hiện connexin 40 và connexin 43 - các protein nằm trong các mối liên kết khe liên tế bào cơ tim trưởng thành, với điều kiện bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố tăng trưởng như: FGF-2 (fibroblast growth factor 2), IGF-1 (insuline - like growth factor 1), BMP-2 (bone morphogenetic protein 2). Các kênh nối chức năng đặc hiệu của tế bào cơ tim được cấu tạo bởi connexin 40 và connexin 43 không chỉ là nơi diễn ra sự thay đổi hiệu điện thế chức năng bất đối xứng cục bộ (partially asymmetric junctional currents) [124], mà còn là kênh cho phép trao đổi các phân tử nhỏ và tín hiệu thứ cấp của các tế bào ở gần nhau, có vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ tế bào cơ tim [56].
1.2.5.3. Giải phóng các cytokin có tác dụng bảo vệ mô tim và hoạt hóa các tế bào tiền thân khác
MSC không chỉ tác động tới các tế bào lân cận thông qua cơ chế tiếp xúc trực tiếp mà còn thông qua hoạt động cận tiết (paracrine), tiết ra các tác nhân
tham gia vào quá trình làm tổ, phân bào, chống apoptosis và tân tạo mạch. Các tác nhân này còn là những tác nhân có vai trò nuôi dưỡng như: VEGF, HGF (hepatocyte growth factor), IGF-1 và SDF-1 (stromal cell-derived factor-1α) [89],[137]. MSC biến đổi gen, tăng cường biểu hiện gen Akt – gen mã hóa cho một loại tín hiệu nội bào có bản chất protein, có khả năng giải phóng ra các yếu tố bảo vệ mô tim, đủ tác động bảo vệ tế bào trong mô hình gây thiếu oxy tâm thất của chuột trưởng thành [53].
Hiện nay, người ta đã chứng minh tác động cận tiết của MSC có thể được sử dụng như một liệu pháp nhằm hoạt hóa các tế bào gốc tim nội sinh. HGF là một trong nhiều yếu tố được tiết ra bởi MSC. Những yếu tố này tác động đến các tế bào gốc tim nội sinh, nhờ đó thúc đẩy sự hoạt hóa, tăng sinh, di chuyển và biệt hóa các tế bào này [84].
MSC cũng tiết ra SDF-1α (stromal cell-derived factor-1α) [137], một chemokin có tác dụng đối với sự di chuyển của EPC, có tác dụng hình thành mạch máu mới. Mặt khác các nghiên cứu cũng cho thấy các chemokin có tác dụng điều tiết sự tuyển mộ HSC và hỗ trợ nuôi dưỡng tế bào cơ tim trong mô cơ tim [137].
1.2.5.4. Biểu hiện đa dạng các marker tế bào cơ trơn, tế bào nội mô và tế bào cơ tim
Tế bào cơ tim trưởng thành biệt hóa cao nên mô cơ tim hạn chế về khả năng tự tái tạo khi xảy ra sự thiếu hụt tế bào do hoại tử. Việc cấy ghép tế bào gốc và tế bào tiền thân vào mô cơ tim không chỉ nhằm tăng sinh các tế bào sau cấy ghép có khả năng co bóp, thay thế các tế bào cơ tim đã mất đi, tạo sự bắt cặp điện cơ với tế bào cơ tim tại chỗ mà còn cần có sự biệt hóa đa dạng tạo nên các loại tế bào khác thuộc mô cơ tim như tế bào nội mô và tế bào cơ trơn [97].
Tác nhân khử methyl hóa DNA (5-azacytidin) từ lâu đã được biết đến như là chất gây biệt hóa MSC theo hướng tạo tế bào cơ tim. Các nghiên cứu chứng
minh rằng khi xử lý với 5-azacytidin, MSC có biểu hiện của kênh Ca2+
và K+ (current flux across) đặc trưng cho tế bào cơ tim [12].
MSC của chuột tăng sinh khi nuôi cấy cùng với tế bào cơ tim hoặc tế bào cơ trơn trưởng thành và biểu hiện các marker của tế bào cơ tim (α-actin, desmin, cTnT) hoặc tế bào cơ trơn (calponin và αSMA) tương ứng [129]. Thêm vào đó, sự biệt hóa MSC theo hướng tế bào nội mô khi có mặt các tác nhân VEGF, IGF- 1 và EGF trong môi trường biệt hóa cũng được mô tả từ nhiều nghiên cứu khác nhau. Các tế bào sau biệt hóa dương tính khi nhuộm với kháng thể kháng von Willebrand factor (vWF) và VEGF receptor-2 (Flk-1) [75].
Đáng chú ý là việc xử lý ex vivo MSC với hỗn hợp insulin, dexamethason
và ascorbic acid gây biểu hiện: troponin I, sarcomeric tropomyosin và titin của tim, do vậy đã hình thành các tế bào dạng tế bào cơ tim [114]. Những phát hiện gần đây cho thấy các protein biểu hiện trong vùng cơ tim bị nhồi máu như TGF-
β1 và BMP-2 có thể cảm ứng in vitro MSC, dẫn tới sự biểu hiện các marker đặc
trưng tim đối với tập hợp MSC này [30].
1.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƢƠNG NGƢỜI
Mật độ MSC trong tủy xương và các mô trưởng thành là rất thấp nên để có
đủ số lượng tế bào cho nghiên cứu in vitro, in vivo cũng như các thử nghiệm lâm
sàng, đòi hỏi phải thực hiện các bước phân lập và nhân nuôi ngoài cơ thể. Điều kiện nuôi cấy còn hỗ trợ việc loại bỏ HSC khi phần lớn HSC không có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy như đối với MSC. Do vậy, có thể nói sự kết hợp hai giai đoạn: phân lập và nuôi cấy đã tạo ra một quần thể MSC nuôi cấy nhất định. Hiện nay những mô tả về đặc điểm của MSC phần lớn có được từ việc nghiên cứu các tập hợp MSC này, những hiểu biết về MSC nguyên thủy còn rất hạn chế.
1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời
Nhiều phương pháp phân lập khác nhau đã được mô tả để có thể thu được một tập hợp chứa MSC từ hỗn hợp ban đầu là các tế bào của tủy xương người. Hiện nay phương pháp phân lập MSC thường dựa trên các nguyên lý là sự kết
hợp đa dạng các đặc tính của MSC: i) khả năng bám dính, ii) các đặc điểm nhân và bào tương, iii) các marker bề mặt âm tính hoặc dương tính.
1.3.1.1. Dựa vào khả năng bám dính của tế bào gốc trung mô
Cơ sở: MSC có các phân tử bám dính trên bề mặt tế bào, do vậy trong điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các tế bào này có khả năng bám đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy và có hình dạng giống nguyên bào sợi [38]. Trong khi đó, HSC trong tủy xương không có khả năng bám dính này, sẽ bị loại bỏ dần khi thay mới môi trường.
Phương pháp phân lập dựa vào khả năng bám dính của MSC là phương pháp được Friedenstein và cs mô tả [44], nhờ đó tác giả phát hiện trong tủy xương chuột một loại tế bào có khả năng bám dính, không thuộc dòng tế bào máu và có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào. Hiện nay khả năng bám dính vẫn được dùng để phân lập MSC. Phương pháp này còn được áp dụng có hiệu quả đối với phân lập MSC có nguồn gốc từ các mô rắn như thành mạch máu, thành dây rốn....và trở thành một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để xác định tập hợp tế bào là MSC sau khi phân lập từ một mô nào đó trong cơ thể [38].
Ngoài ưu điểm là không đòi hỏi nhiều loại trang thiết bị, hạn chế của phương pháp là hiệu quả nuôi cấy sơ cấp MSC từ tủy xương thấp do trong tủy xương chiếm chủ yếu là các tế bào thuộc dòng máu ở nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau.
1.3.1.2. Dựa vào tỷ trọng của tế bào – Kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng
Nguyên lý: Tạo lớp dung dịch tỷ trọng khác biệt với tỷ trọng của loại tế bào cần tách. Trong hỗn hợp tế bào của dịch tủy xương, MSC thuộc loại tế bào đơn nhân, có tỷ trọng tương đương với tế bào lympho và bạch cầu mono. Các tế bào đơn nhân có tỷ trọng thấp hơn hồng cầu và bạch cầu hạt. Một hệ gradient tỷ trọng được tạo ra bằng cách sử dụng một dung dịch có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng của MSC nhưng thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Cho dung dịch tỷ trọng này vào ống ly tâm, nhỏ hỗn dịch tế bào của tủy xương (được pha loãng