1.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Tế bào gốc trung mô đã được giới khoa học biết đến trước khi tên gọi “MSC” ra đời.
- Năm 1867, Cohnheim phát hiện trong tủy xương có các tế bào gốc không thuộc tế bào gốc tạo máu (non-Hematopoietic Stem Cell).
- Từ 1966 – 1987, Friedenstein và cs được coi là một trong những nhà khoa học có các nghiên cứu tiên phong về MSC, mở ra một thời kỳ bùng nổ các báo cáo về loại tế bào gốc này. Từ tủy xương chuột, Friedenstein đã phân lập được một loại tế bào dạng nguyên bào sợi [44], có khả năng bám dính và tăng sinh mạnh trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào này có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào (osteoblasts), tế bào mỡ (adipocytes), tế bào sụn (chondrocytes) và được gọi là tế bào gốc của tủy (marrow stem cells).
- Năm 1991, Caplan đề xuất tên gọi tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) để mô tả các tế bào không đồng nhất, có nguồn gốc tủy xương, có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy thông thường, các tế bào này tăng sinh khi nhân nuôi ngoài cơ thể và có thể biệt hóa để tạo ra các loại tế bào liên kết đa dạng [28]. Tuy nhiên theo một số tác giả khác, các tế bào này thuộc loại tế bào tiền thân và chúng có tên gọi tế bào đệm trung mô (Mesenchymal Stromal Cells - MSC) [97].
- Năm 2004, lần đầu tiên tập hợp MSC chọn lọc sau phân lập và nuôi cấy được sử dụng trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh nhân NMCT cấp [32].
- Năm 2006, Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International Society for Cellular Therapy - ISCT) đưa ra tiêu chuẩn tối thiểu để xác định MSC [38].
1.2.2. Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô
1.2.2.1. Nguồn gốc và khả năng biệt hóa
Đầu tiên MSC được phát hiện từ quần thể các tế bào tủy xương. Ngày nay người ta có thể phân lập các tế bào này từ nhiều mô của cơ thể trưởng thành [18], bao gồm: máu tuần hoàn, máu dây rốn, trung mô dây rốn, tủy xương, mô mỡ, gan, lách, dịch ối ...
Hình 1.3. Khả năng đa biệt hóa in vitro tạo một số dòng tế bào chức năng của tế bào gốc trung mô [70]
MSC là tế bào gốc có khả năng đa biệt hóa, trong đó MSC có khả năng biệt
hóa thành ba loại tế bào (tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn). Các nghiên cứu in
vitro đã chứng minh trong từng môi trường cảm ứng MSC có xu hướng biệt hóa
theo nhiều hướng riêng biệt, không chỉ tạo nên các tế bào thuộc trung bì phôi (tế bào cơ, tế bào xương, tế bào cơ tim) mà còn tạo thành các tế bào thuộc ngoại bì phôi (tế bào thần kinh), hoặc thuộc nội bì phôi (tế bào gan, tụy, biểu mô hô hấp),
Tăng sinh và chuyển dạng thành các dòng tế bào
Biệt hóa và phát triển tế bào cơ
Tế bào sụn Tế bào mỡ Tế bào đệm (tủy) Tế bào xương Tế bào sụn tăng sản Vi môi trường in vitro Nơi cư trú MSC
Tế bào gốc trung mô - MSC
Cụm tế bào tiết insulin
được mô tả ở hình 1.3. Tuy nhiên các bằng chứng về khả năng biệt hóa in vivo
của MSC vẫn chưa thực sự thuyết phục.
1.2.2.2. Marker bề mặt của tế bào gốc trung mô
Xác định các protein bề mặt đặc hiệu tế bào - marker bề mặt, nhằm mục tiêu mô tả đặc điểm và nhận biết một loại tế bào nào đó. Các marker bề mặt của một loại tế bào còn cho biết mối tương tác giữa tế bào này với các tế bào xung quanh và với vi môi trường lân cận.
Bảng 1.1. Phân loại một số marker bề mặt tế bào gốc trung mô [70]
Phân loại marker Các marker
Marker bề mặt CD13, CD29, CD44, CD73, CD90,
CD105, CD106, Stro-1, Sca-1
Thụ thể cytokin
IL-1R hay CD121a ; IL-3R hay CD123, IL-4R hay CD124, IL-6R hay CD126, IL-7R hay CD127
Thụ thể mạng lƣới gian bào
ICAM-1 hay CD54; ICAM-2 hay CD102, VCAM-1 hay CD106, ALCAM hay CD166, CD105, các intergrin của thụ thể
hyaluronate: 1, 2, 3, V, 1, 2, 3, 4 hay tương ứng lần lượt là: CD49a, CD49b, CD49c, CD51, CD29, CD18, CD61, CD104.
Thụ thể tăng trƣởng BFGF-R; PDGF-R hay CD140
Các thụ thể khác IFN-g R hay CD119; TGF-b R;
TNF- R hay CD120
ALCAM: Activated leukocyte cell adhesion molecule: phân tử bám dính tế bào của bạch cầu được hoạt hóa.
BFGF-R: Basis fibroblast growth factor receptor: thụ thể của yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản.
ICAM-1: Intercellular adhesion molecule -1: phân tử bám dính gian bào - 1.
IFN – R: Interferon gama receptor: thụ thể của interferon gama.
IGF-1: Insulin - like growth fartor 1: yếu tố tăng trưởng giống insulin - 1.
IL-R: Interleukine receptor: thụ thể của interleukine.
PDGF-R: Platelet derived growth factor receptor: thụ thể của yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu.
TGF- R: Transforming growth factor bêta receptor: thụ thể của yếu tố chuyển dạng phát triển bêta.
TNF-R: Tumor necrosis factor receptor: thụ thể của yếu tố hoại tử u. Sca-1: Stem cell antigen - 1: kháng nguyên tế bào gốc - 1.
VCAM-1: Vascular adhesion molecule -1: phân tử bám dính thành mạch - 1.
MSC biểu hiện các marker CD44, CD73, CD90 và CD105, trong khi không biểu hiện các marker của dòng tế bào tạo máu như CD14, CD31, CD33, CD34 và CD45. MSC nuôi cấy âm tính với một số marker của tế bào nội mô như yếu tố von-Willebrand và P-selectin [18]. Nghiên cứu của Conget cho thấy trên bề mặt MSC biểu hiện các kháng nguyên liên quan đến sự bám dính ngoại bào như các integrin aVb3 và aVb5 (CD51), các chuỗi đơn integrin a4, a5 và b1 (CD49d, CD49e và CD29); ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) và CD44H [34]. Các phân tử này giúp cho MSC bám dính được với mạng lưới ngoại bào và với bề mặt nhựa nuôi cấy .
MSC có biểu hiện ở mức độ thấp các phân tử MHC (major histocompatibility complex) lớp I và không có các kháng nguyên MHC lớp II. MSC cũng không biểu hiện các phân tử đồng kích thích (co-stimulatory molecule) như B7-1, B7-2, CD80, CD86, CD40 và CD40L [69].
1.2.2.3. Khả năng sinh học
Ngoài vai trò tạo môi trường cho các quá trình tăng sinh và biệt hóa của HSC ở tủy xương, cho đến nay nhiều khả năng sinh học của MSC đã được xác định.
Các mô trưởng thành đều có các vị trí hoặc nơi cư ngụ của các tế bào gốc – thường ở vùng tế bào đệm, nơi có liên hệ chặt chẽ và điều tiết các hoạt động của
các tế bào gốc. In vitro, MSC tổng hợp và tiết ra các cytokin, chemokin và các
yếu tố tăng trưởng [60],[68] như:
- Các Interleukine (IL) : IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15;
- LIF: yếu tố ức chế bạch cầu (leucocyte inhibitory factor);
- G-CSF : yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt (granulocyte colony
stimulating factor);
- GM-CSF: yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào - bạch cầu hạt
(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor);
- Yếu tố tế bào gốc (stem cell factor);
- M-CSF: yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào (macrophage colony-
stimulating factor);
- flk-3L: ligand của tyrosine kinase -3 giống fms (fms like tyrosine kinase-3
ligand).
Do MSC có các thụ thể của cytokin như: IL-1R (interleukin 1 receptor), IL- 3R (interleukin 3 receptor), IL-4R (interleukin 4 receptor), IL-6R (interleukin 6 receptor) và IL-7R (interleukin 7 receptor) nên khi bị cảm ứng bởi các cytokin này, chúng tiết ra nhiều loại chemokin bạch cầu ở mức độ cao, đáng chú ý nhất là CXCL9 (CXC9 ligand), CXCL10 (CXC10 ligand) và CXCL11 (CXC 11 ligand).
Mặc dù chưa tìm ra marker bề mặt nào là marker duy nhất đặc hiệu cho MSC nhưng hàng loạt các marker đã được xác định cùng với khả năng tiết các cytokin và chemokin của MSC đã gợi ý khả năng chia sẻ các tín hiệu gian bào và khả năng tương tác của MSC với các tế bào khác trong quá trình tăng sinh và biệt hóa.
Khả năng di chuyển và định cư ngoài tủy xương
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh: khi đưa vào cơ thể động vật thực nghiệm, MSC nuôi cấy có thể định cư ở ngoài tủy xương, đặc biệt vào các vùng mô bị
tổn thương và tại đó chúng có khả năng tăng cường quá trình làm liền vết thương, hỗ trợ sự tái tạo mô; và có thể khôi phục vi môi trường của tủy xương trong mô hình thực nghiệm loại bỏ tủy bằng liệu pháp hóa học (myeloablative chemotherapy) hoặc xâm nhập vào các khối u [102]. Sự di chuyển đặc hiệu của MSC được cho là do sự tác động của các chemokin. Thực tế, các nghiên cứu đã tìm thấy sự biểu hiện các thụ thể của các chemokin: CCR1(CC1 receptor), CCR4 (CC4 receptor), CCR7 (CC7 receptor), CXCR5 (CXC5 receptor) và CCR10 (CC10 receptor) trên các MSC [62],[126], những thụ thể có thể có vai trò đối với khả năng di chuyển đặc hiệu trên.
Cũng như các loại tế bào gốc khác, MSC chịu sự điều hòa của vi môi trường nơi chúng tồn tại. Vi môi trường này được tạo nên bởi nhiều yếu tố và với các mức độ khác nhau, các yếu tố này có thể tương tác độc lập nhưng chủ yếu là dưới dạng phối hợp tác động lên tế bào. Biểu hiện gen của các cytokin và chemokin của MSC phân lập từ phổi khác biệt so với MSC có nguồn gốc tủy xương. Điều này có thể là do vi môi trường của các mô khác nhau đã xác lập các chức năng khác nhau của MSC [71]. Sau khi bị kích thích bởi các tổn thương cơ học, quá trình viêm, nhiễm trùng và ung thư, MSC di cư khỏi nơi trú ngụ của chúng và thâm nhập vào các vùng tổn thương, dẫn đến quá trình tái tạo mô. Các tín hiệu cụ thể trong quá trình tác động của MSC nhằm sửa chữa các tổn thương cho tới nay vẫn chưa được biết một cách rõ ràng. Đặc tính này của MSC nếu được áp dụng sẽ hình thành một liệu pháp điều trị mới tạo điều kiện sửa chữa các mô bị tổn thương [29].
Khả năng ức chế miễn dịch
MSC được cho là loại tế bào có khả năng ức chế miễn dịch. Tác dụng chung của MSC trên hệ miễn dịch là “lái” các đáp ứng miễn dịch theo chiều hướng dung nạp hoặc kháng viêm, thể hiện ở sự chuyển dạng Th1 (T - helper type 1)
thành dạng Th2 (T - helper type 2), giảm tổng hợp IFN - (interferon gama) từ
tế bào giết tự nhiên (natural killer cell - NK cell) và giảm sản xuất kháng thể của tế bào lympho B. Do vậy, MSC điều tiết quá trình hình thành dòng lympho và
ức chế đáp ứng miễn dịch dịch thể. MSC tủy xương tham gia vào quá trình trưởng thành của tế bào lympho T và tế bào lympho B thông qua các yếu tố tăng trưởng, các cytokin, các phân tử bám dính [7]. Ngoài ra, MSC điều chỉnh tác dụng điều hòa miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch mắc phải nhờ sự tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các yếu tố hòa tan [73]. MSC không có MHC lớp II do vậy chúng có khả năng vượt qua được hàng rào miễn dịch trong các liệu pháp cấy ghép khác gen cùng loài [72].
1.2.3. Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô
Nghiên cứu khả năng biệt hóa in vitro của MSC được tiến hành từ rất sớm.
Bắt đầu là các nghiên cứu về khả năng biệt hóa tạo các loại tế bào thuộc tập hợp tế bào đệm tủy xương (tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn). Sự hình thành các tế bào này được cho là do quá trình biệt hóa của MSC trong tủy xương [48]. Sau đó là hàng loạt những nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng tạo ra các loại tế bào có cùng nguồn gốc hay khác nguồn gốc phôi thai như: tế bào cơ, tế bào cơ tim, tế bào thuộc hệ thần kinh, tế bào gan, tế bào tụy [48]. Các nghiên cứu này nhắm tới việc sử dụng liệu pháp tế bào trong việc tái tạo, phục hồi các mô khi
cần thiết. Khả năng biệt hóa in vitro tạo ra 3 loại tế bào nêu trên (tạo cốt bào, tế
bào mỡ, tế bào sụn) được ISCT chọn là một trong ba tiêu chuẩn tối thiểu để khẳng định tập hợp tế bào thu được sau phân lập, nuôi cấy từ nhiều nguồn là tập hợp MSC [38].
1.2.3.1. Biệt hóa tạo tạo cốt bào
Tác nhân gây biệt hóa: Các nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng hình thành các tế bào khoáng hóa sử dụng nhiều loại tác nhân như BMP (bone morphogenetic protein), dexamethasone, 1,25 dihydroxy vitamin D3, acid
ascorbic và -glycerophosphate [34],[94]. Các tác nhân này gắn với các thụ thể
tương ứng như: dexamethasone gắn với thụ thể của glucocorticoid, 1,25 dihydroxy vitamin D3 gắn với thụ thể của vitamin D. Quá trình đáp ứng hình thành tạo cốt bào của MSC tăng lên khi bổ sung các loại BMP vào môi trường nuôi cấy.
Kết quả biệt hóa
Các tế bào xuất hiện tượng tạo khoáng trong bào tương sau 14 21 ngày
biệt hóa. Phương pháp nhuộm hóa tế bào Alizarin đỏ hoặc von - Kossa xác định có hay không sự lắng đọng calcium phosphate trong tế bào. Ngoài ra có thể xác định kết quả biệt hóa tạo tạo cốt bào bằng cách phân tích sự biểu hiện một số protein đặc trưng khác, như: osteocalcin – một protein không thuộc collagen, được tiết ra bởi tạo cốt bào và có liên quan đến mạng lưới khoáng hóa của mô xương; hay sự biểu hiện của yếu tố phiên mã của tạo cốt bào Cbfa1 (core binding factor alpha1) [39].
Hình 1.4. Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mô sau biệt hóa thành tạo cốt bào (C) và không định hướng biệt hóa (D) [37]
Một giả thuyết được đưa ra là quá trình tạo mỡ và xương của MSC có mối liên quan thuận nghịch, do các tác nhân sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo tế bào mỡ cũng được sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo xương và ngược lại [40],[50].
1.2.3.2. Biệt hóa tạo tế bào mỡ
Tác nhân gây biệt hóa : MSC biệt hóa hình thành các tế bào mỡ khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy hỗn hợp dexamethason, indomethacin, insulin, isobutylmethylxanthin, thiazolidinedion [34],[51].
Tác dụng phổ biến của các tác nhân biệt hóa là làm tăng cAMP trong bào tương do ức chế hoạt tính của enzym phosphodiesterase như : isobutylmethylxanthin. Các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy là các ligand của các thụ thể màng nhân như : dexamethason của thụ thể
glucocorticoid; rosiglitazon của PPAR (peroxisome proliferator-activated
receptor ).
Kết quả biệt hóa
MSC thay đổi hình dạng tế bào từ dạng hình sợi sang dạng hình ovan, có chứa các giọt mỡ trong bào tương sau từ 3 ÷ 9 ngày biệt hóa. Các hạt mỡ có thể quan sát trực tiếp dưới KHV quang học đối pha do chúng có độ chiết quang khác với độ chiết quang của nước.
Hình 1.5. Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa
thành tế bào mỡ (E) và không định hướng biệt hóa (F) [37]
Các hạt mỡ được hình thành bắt màu thuốc nhuộm chuyên biệt (Oil - Red O), quan sát được dưới KHV quang học. Ngoài ra có thể xác định biểu hiện các marker về gen của tế bào mỡ trưởng thành như: Protein gắn với acid béo 4 (fatty acid-binding protein 4), lipoprotein lipase; các adipokin (adiponectin, leptin) và các tế bào mỡ này bị phân giải lipid bởi các chất chủ vận adrenergic (adrenergic agonist) [34],[49],[111].
1.2.3.3. Biệt hóa tạo tế bào sụn
Tác nhân biệt hóa: Các tác nhân gây biệt hóa MSC hình thành tế bào sụn bao gồm: ascorbate, BMP 6 (bone morphogenetic protein 6), dexamethason,
TGF-β (transforming growth factor β) [64],[78]. Ngoài việc sử dụng các tác
nhân bổ sung vào môi trường nuôi cấy vừa nêu trên, quá trình biệt hóa MSC theo hướng tạo tế bào sụn cần được tiến hành trong điều kiện nuôi cấy không gian ba chiều. Đây là điều kiện nuôi cấy khác biệt so với nuôi cấy tế bào bám dính đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy tương ứng với điều kiện nuôi cấy không gian hai chiều. Theo cách này, môi trường nuôi cấy chứa các hạt vi khối lượng hoặc nuôi cấy trong mạng lưới như agarose hoặc alginate.
Kết quả biệt hóa
MSC sau biệt hóa biểu hiện các protein đặc trưng cho tổ chức sụn: Collagen typ II, Collagen typ X, Aggrecan.
Hình 1.6. Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mô sau biệt hóa thành tế bào sụn (G) và không định hướng biệt hóa (H) [37]
1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của một tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy
Nhiều cố gắng tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm kiểu hình của MSC đã được tiến hành, nhưng cho đến nay người ta vẫn chưa xác được marker bề mặt