Các bằng chứng in vivo và in vitro cho thấy MSC là loại tế bào gốc có tiềm
năng nhất so với các loại tế bào gốc và tế bào tiền thân khác đã được nghiên cứu với mục đích sửa chữa tái tạo mô cơ tim trong điều trị các bệnh tim mạch nói chung và NMCT nói riêng.
MSC có nhiều đặc tính nổi trội với vai trò ứng cử viên cho liệu pháp cấy
ghép tế bào, bao gồm: i) dễ dàng nuôi cấy đạt số lượng lớn; ii) có tiềm năng sửa
chữa thành mạch cũng như cơ tim; iii) có các thuộc tính điều hòa miễn dịch và
khả năng ứng dụng trong điều trị đồng loại (allogenetic). Những đặc tính này là
kết quả thu được từ các nghiên cứu cơ bản cũng như những ứng dụng điều trị tim mạch.
1.2.5.1. Sự biểu hiện các marker đặc hiệu cơ tim
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh MSC có được kiểu hình của tế bào cơ tim
khi biệt hóa in vitro (bằng 5-azacytidin) và in vivo (trong mô hình chuột bị gây
NMCT) [122]. Ngoài ra, một số phương pháp biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế
Các marker đặc hiệu tế bào cơ tim như: yếu tố phiên mã đặc hiệu tim (Nkx2.5, GATA4) và các protein thuộc đơn vị co cơ (sacomeres) như: myosin chuỗi nặng của tim (cardiac myosin heavy chain - MHC), α-sarcomeric actinin, cTnT (cardiac troponin T) biểu hiện ở MSC khi đồng nuôi cấy với tế bào cơ tim trưởng thành [8],[133],[136]. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh khả năng MSC biểu hiện kiểu hình của tế bào cơ tim trong mô cơ tim khỏe mạnh cũng như mô cơ tim bị nhồi máu [112],[122].
Không chỉ biểu hiện các protein co cơ, MSC trong điều kiện nuôi cấy giọt treo, sau đó là nuôi cấy trong mạng lưới ngoại bào (extracellular matrix - ECM) đã được chứng minh là có khả năng hình thành các protein đặc hiệu khác của tế bào cơ tim như: α1c - các tiểu đơn vị α của kênh canxi loại L đặc hiệu tim (cardiac-specific L-type calcium channel), Kv4.3 – kênh vận chuyển kali ra ngoài (transient outward potassium channel) và ANP [138],[96].
1.2.5.2. Sự kết nối tế bào – tế bào thông qua các mối liên kết khe (gap junctions)
Khả năng liên kết của MSC với các tế bào cơ tim tại chỗ được chứng minh khi các MSC này biểu hiện connexin 40 và connexin 43 - các protein nằm trong các mối liên kết khe liên tế bào cơ tim trưởng thành, với điều kiện bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố tăng trưởng như: FGF-2 (fibroblast growth factor 2), IGF-1 (insuline - like growth factor 1), BMP-2 (bone morphogenetic protein 2). Các kênh nối chức năng đặc hiệu của tế bào cơ tim được cấu tạo bởi connexin 40 và connexin 43 không chỉ là nơi diễn ra sự thay đổi hiệu điện thế chức năng bất đối xứng cục bộ (partially asymmetric junctional currents) [124], mà còn là kênh cho phép trao đổi các phân tử nhỏ và tín hiệu thứ cấp của các tế bào ở gần nhau, có vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ tế bào cơ tim [56].
1.2.5.3. Giải phóng các cytokin có tác dụng bảo vệ mô tim và hoạt hóa các tế bào tiền thân khác
MSC không chỉ tác động tới các tế bào lân cận thông qua cơ chế tiếp xúc trực tiếp mà còn thông qua hoạt động cận tiết (paracrine), tiết ra các tác nhân
tham gia vào quá trình làm tổ, phân bào, chống apoptosis và tân tạo mạch. Các tác nhân này còn là những tác nhân có vai trò nuôi dưỡng như: VEGF, HGF (hepatocyte growth factor), IGF-1 và SDF-1 (stromal cell-derived factor-1α) [89],[137]. MSC biến đổi gen, tăng cường biểu hiện gen Akt – gen mã hóa cho một loại tín hiệu nội bào có bản chất protein, có khả năng giải phóng ra các yếu tố bảo vệ mô tim, đủ tác động bảo vệ tế bào trong mô hình gây thiếu oxy tâm thất của chuột trưởng thành [53].
Hiện nay, người ta đã chứng minh tác động cận tiết của MSC có thể được sử dụng như một liệu pháp nhằm hoạt hóa các tế bào gốc tim nội sinh. HGF là một trong nhiều yếu tố được tiết ra bởi MSC. Những yếu tố này tác động đến các tế bào gốc tim nội sinh, nhờ đó thúc đẩy sự hoạt hóa, tăng sinh, di chuyển và biệt hóa các tế bào này [84].
MSC cũng tiết ra SDF-1α (stromal cell-derived factor-1α) [137], một chemokin có tác dụng đối với sự di chuyển của EPC, có tác dụng hình thành mạch máu mới. Mặt khác các nghiên cứu cũng cho thấy các chemokin có tác dụng điều tiết sự tuyển mộ HSC và hỗ trợ nuôi dưỡng tế bào cơ tim trong mô cơ tim [137].
1.2.5.4. Biểu hiện đa dạng các marker tế bào cơ trơn, tế bào nội mô và tế bào cơ tim
Tế bào cơ tim trưởng thành biệt hóa cao nên mô cơ tim hạn chế về khả năng tự tái tạo khi xảy ra sự thiếu hụt tế bào do hoại tử. Việc cấy ghép tế bào gốc và tế bào tiền thân vào mô cơ tim không chỉ nhằm tăng sinh các tế bào sau cấy ghép có khả năng co bóp, thay thế các tế bào cơ tim đã mất đi, tạo sự bắt cặp điện cơ với tế bào cơ tim tại chỗ mà còn cần có sự biệt hóa đa dạng tạo nên các loại tế bào khác thuộc mô cơ tim như tế bào nội mô và tế bào cơ trơn [97].
Tác nhân khử methyl hóa DNA (5-azacytidin) từ lâu đã được biết đến như là chất gây biệt hóa MSC theo hướng tạo tế bào cơ tim. Các nghiên cứu chứng
minh rằng khi xử lý với 5-azacytidin, MSC có biểu hiện của kênh Ca2+
và K+ (current flux across) đặc trưng cho tế bào cơ tim [12].
MSC của chuột tăng sinh khi nuôi cấy cùng với tế bào cơ tim hoặc tế bào cơ trơn trưởng thành và biểu hiện các marker của tế bào cơ tim (α-actin, desmin, cTnT) hoặc tế bào cơ trơn (calponin và αSMA) tương ứng [129]. Thêm vào đó, sự biệt hóa MSC theo hướng tế bào nội mô khi có mặt các tác nhân VEGF, IGF- 1 và EGF trong môi trường biệt hóa cũng được mô tả từ nhiều nghiên cứu khác nhau. Các tế bào sau biệt hóa dương tính khi nhuộm với kháng thể kháng von Willebrand factor (vWF) và VEGF receptor-2 (Flk-1) [75].
Đáng chú ý là việc xử lý ex vivo MSC với hỗn hợp insulin, dexamethason
và ascorbic acid gây biểu hiện: troponin I, sarcomeric tropomyosin và titin của tim, do vậy đã hình thành các tế bào dạng tế bào cơ tim [114]. Những phát hiện gần đây cho thấy các protein biểu hiện trong vùng cơ tim bị nhồi máu như TGF-
β1 và BMP-2 có thể cảm ứng in vitro MSC, dẫn tới sự biểu hiện các marker đặc
trưng tim đối với tập hợp MSC này [30].
1.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƢƠNG NGƢỜI
Mật độ MSC trong tủy xương và các mô trưởng thành là rất thấp nên để có
đủ số lượng tế bào cho nghiên cứu in vitro, in vivo cũng như các thử nghiệm lâm
sàng, đòi hỏi phải thực hiện các bước phân lập và nhân nuôi ngoài cơ thể. Điều kiện nuôi cấy còn hỗ trợ việc loại bỏ HSC khi phần lớn HSC không có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy như đối với MSC. Do vậy, có thể nói sự kết hợp hai giai đoạn: phân lập và nuôi cấy đã tạo ra một quần thể MSC nuôi cấy nhất định. Hiện nay những mô tả về đặc điểm của MSC phần lớn có được từ việc nghiên cứu các tập hợp MSC này, những hiểu biết về MSC nguyên thủy còn rất hạn chế.
1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời
Nhiều phương pháp phân lập khác nhau đã được mô tả để có thể thu được một tập hợp chứa MSC từ hỗn hợp ban đầu là các tế bào của tủy xương người. Hiện nay phương pháp phân lập MSC thường dựa trên các nguyên lý là sự kết
hợp đa dạng các đặc tính của MSC: i) khả năng bám dính, ii) các đặc điểm nhân và bào tương, iii) các marker bề mặt âm tính hoặc dương tính.
1.3.1.1. Dựa vào khả năng bám dính của tế bào gốc trung mô
Cơ sở: MSC có các phân tử bám dính trên bề mặt tế bào, do vậy trong điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các tế bào này có khả năng bám đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy và có hình dạng giống nguyên bào sợi [38]. Trong khi đó, HSC trong tủy xương không có khả năng bám dính này, sẽ bị loại bỏ dần khi thay mới môi trường.
Phương pháp phân lập dựa vào khả năng bám dính của MSC là phương pháp được Friedenstein và cs mô tả [44], nhờ đó tác giả phát hiện trong tủy xương chuột một loại tế bào có khả năng bám dính, không thuộc dòng tế bào máu và có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào. Hiện nay khả năng bám dính vẫn được dùng để phân lập MSC. Phương pháp này còn được áp dụng có hiệu quả đối với phân lập MSC có nguồn gốc từ các mô rắn như thành mạch máu, thành dây rốn....và trở thành một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để xác định tập hợp tế bào là MSC sau khi phân lập từ một mô nào đó trong cơ thể [38].
Ngoài ưu điểm là không đòi hỏi nhiều loại trang thiết bị, hạn chế của phương pháp là hiệu quả nuôi cấy sơ cấp MSC từ tủy xương thấp do trong tủy xương chiếm chủ yếu là các tế bào thuộc dòng máu ở nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau.
1.3.1.2. Dựa vào tỷ trọng của tế bào – Kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng
Nguyên lý: Tạo lớp dung dịch tỷ trọng khác biệt với tỷ trọng của loại tế bào cần tách. Trong hỗn hợp tế bào của dịch tủy xương, MSC thuộc loại tế bào đơn nhân, có tỷ trọng tương đương với tế bào lympho và bạch cầu mono. Các tế bào đơn nhân có tỷ trọng thấp hơn hồng cầu và bạch cầu hạt. Một hệ gradient tỷ trọng được tạo ra bằng cách sử dụng một dung dịch có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng của MSC nhưng thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Cho dung dịch tỷ trọng này vào ống ly tâm, nhỏ hỗn dịch tế bào của tủy xương (được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy) lên phía trên sao cho tạo được diện tiếp xúc phân biệt
giữa hai lớp. Sau khi ly tâm, tập hợp tế bào đơn nhân có chứa MSC tạo thành một lớp tế bào “vòng nhẫn”, nằm sát trên lớp dung dịch tỷ trọng. Hồng cầu và bạch cầu hạt nằm ở đáy ống, phía dưới của lớp dung dịch tỷ trọng.
- Các loại dung dịch tỷ trọng: Trong phân lập MSC cũng như tế bào đơn nhân tủy xương, người ta thường sử dụng dung dịch có tỷ trọng 1,073 g/ml hoặc 1,077 g/ml, ví dụ:
* Các sản phẩm Ficoll: Ficoll là dung dịch chứa các hạt polysaccharid (sucrose) trọng lượng phân tử cao và natri diatrizoate trung tính, kị nước, kích thước hạt từ 2 ÷ 7 nm. Histopaque - 1077 và Ficoll – uromiro là các loại dung dịch Ficoll có tỷ trọng 1,077 g/ml.
* Các sản phẩm Percoll: Percoll là dung dịch chứa các hạt colloidal silica, đường kính 15 ÷ 30 mm (23% w/w trong nước), được bao phủ bởi polyvinylpyrrolidon. Percoll được dùng trong phân tách các tế bào, bào quan, virut bằng ly tâm tỷ trọng do có độ nhớt thấp, độ thẩm thấu (osmolarity) thấp, không gây độc cho tế bào và các thành phần của tế bào.
Kỹ thuật ly tâm gradient theo tỷ trọng thu hoạch các tế bào đơn nhân tủy
xương là kỹ thuật được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu phân lập MSC in
vivo và in vitro, với ưu điểm là dễ tiến hành và mang lại hiệu quả phân lập cao. Kỹ thuật này có thể phối hợp với các kỹ thuật khác nhằm tăng cường hiệu quả và chất lượng phân lập MSC từ nhiều loại dịch cơ thể khác nhau: dịch hút mỡ, dịch hút tủy xương, máu tuần hoàn, dịch ối.
1.3.1.3. Dựa vào các kháng nguyên bề mặt
Cơ sở: MSC đã được xác định biểu hiện một số marker bề mặt đặc trưng [38], tuy nhiên đây là sự mô tả tập hợp MSC sau khi đã phân lập và nuôi cấy. Một số marker khác hiện đã được sử dụng để chọn lựa trực tiếp từ tủy xương để có được một tập hợp tế bào có khả năng tăng sinh mạnh và có các đặc điểm của MSC, bao gồm: Stro – 1, CD49a, CD146, CD271 [103]. Việc sử dụng các marker bề mặt thông qua phản ứng miễn dịch để chọn lọc âm tính hoặc dương tính. Quá trình chọn lọc tế bào sau đó được thực hiện trên các thiết bị chuyên
dụng như: thiết bị đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometer) – phương pháp FACS (Fluorescence-activated cell sorting) hoặc cột từ trường – phương pháp MACS (Magnetic-activated cell sorting).
1.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô
1.3.2.1. Điều kiện nuôi cấy cơ bản
Cũng như các loại tế bào động vật khác, các điều kiện nuôi cấy MSC cũng phải tuân thủ các tiêu chuẩn bắt buộc của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thông thường. Các tiêu chuẩn liên quan đến điều kiện vô trùng, nhiệt độ, pH môi trường nuôi
cấy, độ ẩm và nồng độ CO2.
Bảng 1.2. Một số điều kiện nuôi cấy cơ bản tế bào gốc trung mô [31]
Điều kiện nuôi cấy Khuyến cáo
Môi trường nuôi cấy α-MEM, 10% FBS (fetal bovine serum)
Kích thước đĩa nuôi cấy Nuôi cấy sơ cấp cho đến cấy chuyển thứ 2: 25 cm
2
Từ cấy chuyển thứ 3 trở đi: 75 cm2
Mật độ trải tế bào sau phân
lập 50,000 tế bào đơn nhân/cm
2
Mật độ trải tế bào sau cấy
chuyển 1000 tế bào/cm
2
Mục đích của nuôi cấy MSC là làm tăng số lượng MSC trong một tập hợp tế bào với tỷ lệ thấp. Tuy nhiên, với đặc tính tăng sinh mạnh trong điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể của MSC thì việc nuôi cấy MSC không gặp nhiều trở ngại. Điều quan trọng cần đạt được trong nuôi cấy là vừa phải thu được một lượng lớn tế bào trong khi phải duy trì trạng thái ít biệt hóa nhất của quần thể MSC nuôi cấy. Thực tế, nhiều điều kiện nuôi cấy cơ bản ảnh hưởng đến tế bào nói chung và MSC nói riêng, bao gồm: môi trường, mật độ tế bào, giá đỡ, nồng độ oxy thấp và phương thức nuôi cấy.
Bảng 1.3. Một số loại môi trường và huyết thanh được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào gốc trung mô
Môi trƣờng nuôi cấy α-MEM ( - Modified Eagle medium)
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)
Huyết thanh FBS (fetal bovine serum)
NCS (newborn calf serum)
1.3.2.2. Điều kiện nuôi cấy tăng cường khả năng tăng sinh
Khả năng tăng sinh và phát triển của MSC bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các điều kiện này làm thay đổi hình thái và đặc tính sinh học của tế bào nuôi cấy. Ở các điều kiện nuôi cấy quy chuẩn đã được công bố, MSC phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy dưới dạng đơn lớp. Nuôi cấy trong môi
trường thiếu oxy – điều kiện in vivo ở nhiều khối u, MSC tiếp tục tăng sinh
trong khi mật độ tế bào đã tăng cao và có tốc độ tăng sinh gấp 30 lần [54]. Từ kết quả này có thể đưa ra khả năng tác động vào các khối u thông qua tác động của MSC. Theo đó, người ta có thể truyền một lượng nhỏ MSC sau khi gây thiếu oxy cấp tính các khối u. Lúc này chỉ với lượng nhỏ MSC được đưa vào, các tế bào này vẫn có thể phát huy tác dụng một cách hiệu quả nhờ khả năng tăng sinh của chúng.
Ngoài ra, khả năng tăng sinh của MSC người có thể được tăng cường khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố tăng trưởng [117] hoặc sử dụng bề mặt nuôi cấy bám dính [101]. Các giá đỡ phủ Collagen I cải thiện sự bám dính tế bào, tăng cường tốc độ tăng sinh của MSC lên 3 lần [101].
MSC cũng tăng khả năng phát triển khi đồng nuôi cấy với các tế bào glioma hoặc trong môi trường nuôi cấy của các tế bào này [20]. Ngược lại, việc bổ sung MMTV (mouse mammary tumor virus) - protein tái tổ hợp dạng wingless
(transforming growth factor 1) và TGF-2 (transforming growth factor 2) [106] làm giảm sự tăng sinh của MSC. Khả năng tăng sinh của MSC không duy
trì được trong quá trình nuôi cấy kéo dài do biểu hiện tăng cường TGF
(transforming growth factor ), TGF-R1 (transforming growth factor
receptor 1) và Smad3 nội sinh [106].
1.4. LIỆU PHÁP TẾ BÀO ĐỐI VỚI MỘT SỐ BỆNH LÝ TIM MẠCH 1.4.1. Sự cần thiết áp dụng liệu pháp tế bào đối với bệnh lý tim mạch