trung mô tủy xƣơng ngƣời theo hƣớng tạo tế bào cơ tim
2.3.2.1. Quy trình phân lập tế bào đơn nhân tủy xương của Shim và cs [114]
Tủy xương vùng xương chậu của các bệnh nhân được lấy theo kỹ thuật tại khoa Huyết học Bệnh viện TW Quân đội 108 và khoa Huyết học Bệnh viện Bạch mai, bảo quản trong ống nghiệm có chất chống đông, vô trùng. Dịch tuỷ
xương sẽ được tách lấy các tế bào đơn nhân sau khi lấy mẫu 4 6 giờ.
1) Cho 1 ml tủy xương vào ống Falcon loại 15 ml.
2) Cho tiếp 50 l - Human mesenchymal enrichment cocktail vào trộn đều bằng
pipet. Ủ hỗn dịch tủy xương - cocktail ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
3) Cho 6 ml DMEM - LG - 10% FBS có 100 UI/ml penicillin, 100 g/ml
streptomycin vào hỗn dịch tủy xương trên, trộn đều.
4) Chuẩn bị 1 ống Falcon khác chứa sẵn 7 ml dung dịch Histopaque -1077.
5) Đặt nhẹ nhàng toàn bộ thể tích hỗn dịch tủy xương lên trên lớp dịch
Histopaque - 1,077, tránh để hai lớp dịch lẫn vào nhau.
6) Ly tâm 1500 vòng/ phút x 30 phút, nhiệt độ phòng.
Trước ly tâm Sau ly tâm
Hình 2.1. Mô hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng Tủy xƣơng DMEM Histopaque 1,077 Huyết tƣơng DMEM TB đơn nhân Histopaque 1,077 Bạch cầu hạt và hồng cầu L LIITTÂÂMM
7) Thu thập lớp tế bào “vòng nhẫn” (khoảng 3 ÷ 4 ml), vào ống Falcon 15 ml khác. Lớp “vòng nhẫn” nằm giữa lớp môi trường nuôi cấy, huyết thanh (màu hồng) ở trên và lớp dịch Histopaque -1,077 (trắng) ở dưới.
8) Cho thêm 5 ml DMEM - LG - 10% FBS, 100 UI/ml penicillin, 100 g/ml
streptomycin vào dịch tế bào vừa thu được.
9) Ly tâm ở 1200 vòng/phút x 10 phút.
10) Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn tế bào.
11) Lặp lại bước 8, 9, 10.
12) Tạo huyền phù tế bào thu được bằng 4 ml DMEM – LG, 10% FBS, 100
UI/ml penicillin, 100 g/ml streptomycin.
13) Đếm số lượng tế bào, xác định mật độ.
14) Cho dịch huyền phù tế bào vào chai nuôi cấy 25cm2
(P0).
Tiêu chuẩn phân lập thành công: Thu hoạch được > 109
tế bào/ml dịch tủy xương.
2.3.2.2. Quy trình nhân nuôi tế bào gốc trung mô
Nuôi cấy sơ cấp: Đây là giai đoạn P0. Các tế bào đơn nhân sau khi phân lập được từ tủy xương được nuôi cấy sơ cấp trong: DMEM-LG, 10% FBS,
100 UI/ml penicillin, 100 g/ml streptomycin - môi trường nuôi cấy, ở 370C, 5%
CO2.Không thay mới môi trường trong 7 ÷ 9 ngày. Sau đó loại bỏ tế bào không
bám dính bằng cách thay mới môi trường nuôi cấy. Môi trường này được thay mới 2 lần/tuần, liên tục cho đến khi tế bào phát triển 60 ÷ 70 % diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy (khoảng ngày thứ 14 ÷ 21).
Tiêu chuẩn nuôi cấy sơ cấp thành công: Tế bào phát triển và che phủ 70 ÷ 80% bề mặt diện tích nuôi cấy sau 20 ngày.
Cấy chuyển và nuôi cấy thứ cấp: Tiến hành cấy chuyển khi mật độ tế bào đạt 60 ÷ 70% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy. Ký hiệu P1 – P2 .... theo số lần cấy chuyển.
1) Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ bằng cách đổ bỏ.
3) Tách các tế bào bám khỏi bề mặt chai nuôi bằng trypsin – EDTA 0,25% (2
ml/ chai T25). Ủ trong tủ ấm 37o
C trong vòng 2 ÷ 3 phút (kiểm tra dưới KHV đối pha, nếu tế bào có hình tròn là đã tách khỏi bề mặt nhựa nuôi).
4) Huyền phù bằng môi trường có bổ sung huyết thanh (5 ml/chai T25). Rửa tế
bào bằng ly tâm ở 1000 vòng/5 phút. Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới (tỷ lệ 1/3).
5) Môi trường nuôi cấy được thay mới 2 lần/tuần, liên tục cho đến khi tế bào
phát triển 60 ÷ 70 % diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy.
Tiêu chuẩn nuôi cấy thứ cấp thành công: Tế bào phát triển và che phủ 70 ÷
80% bề mặt diện tích nuôi cấy sau 7 8 ngày sau cấy chuyển.
2.3.2.3. Quy trình bảo quản lạnh, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô
Bảo quản lạnh các tế bào MSC (P1) trong dung dịch bảo quản tế bào, lưu giữ ở - 800
C, trong 3 tháng. Sau thời gian bảo quản, tế bào được đánh thức, phục hồi nuôi cấy theo quy trình nuôi cấy thông thường.
Bảo quản tế bào trong nhiệt độ - 800
C
1) Lấy chai chứa tế bào nuôi cấy ra khỏi buồng nuôi cấy hút bỏ hết môi
trường nuôi cấy cho 5 ml PBS để rửa hút bỏ dung dịch rửa.
2) Cho 1 ml trypsin – EDTA 0,25% lắc nhẹ ủ ở 370C x 2 3 phút (chú ý:
vừa ủ vừa kiểm tra trên KHV quang học, các tế bào bong đều khỏi bề mặt nhựa hoặc giếng nuôi cấy là được, tránh ủ quá lâu tế bào sẽ bị chết).
3) Bất hoạt enzym bằng cách cho vào 10 ml môi trường nuôi cấy có chứa FBS.
4) Ly tâm 1200 vòng/phút x 5 phút bỏ dịch nổi.
5) Pha lại cặn tế bào bằng 10 – 20 ml môi trường (tùy thuộc lượng tế bào).
6) Đếm tế bào (sử dụng buồng đếm Improved Neubauer). Pha 90 µl trypan blue
0,25% và 10 µl dịch tế bào trộn đều đếm tổng số tế bào (n) của 4 ô
vuông xung quanh bằng vật kính x10 Tổng số tế bào thu được: n/4 x 104 x
7) Ly tâm bỏ dịch nổi pha lại bằng môi trường nuôi cấy chứa 10%
DMSO để có khoảng 2 3 x 106 tế bào trong 1 ml.
8) Cho 1 ml dung dịch tế bào vào mỗi ống nghiệm nhỏ (microtube) làm
đông bằng dung dịch iso-propyl alcohol (C3H7OH) như sau: ngâm ống
nghiệm vào bình chứa iso-propyl alcohol để trong tủ lạnh - 800C (mỗi
phút nhiệt độ của dung dịch sẽ giảm - 0,10
C).
9) Sau 1 2 ngày, chuyển ống nghiệm đựng tế bào trực tiếp tủ lạnh – 800C. Sau
3 tháng sẽ đánh thức và phục hồi nuôi cấy tế bào.
Hình 2.2. Dụng cụhạ nhiệt độ bảo quản tế bào nuôi cấy
Phục hồi nuôi cấy tế bào sau bảo quản
1) Lấy các ống nghiệm đựng tế bào ra từ tủ lạnh - 800C mở nhẹ nắp ống
ủ trong bể ấm 370
C (chú ý: khi dung dịch tế bào tan còn lại một cục đã nhỏ bên trong ống là được).
2) Tế bào sau khi rã đông có thể dùng để nuôi cấy tiếp. Ly tâm, rửa tế bào bằng
PBS x 2 lần hòa tế bào bằng môi trường nuôi cấy đưa vào chai nuôi
cấy và nuôi cấy theo quy trình.
Tiêu chuẩn nuôi cấy phục hồi thành công: Tế bào phát triển và che phủ 70 ÷ 80% bề mặt diện tích nuôi cấy sau 20 ngày.
2.3.2.4. Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô theo hướng tạo tế bào cơ tim
Quy trình biệt hóa bằng theo quy trình của Tomita và cs [123]
MSC được tiến hành biệt hóa tại P1. Loại bỏ toàn bộ môi trường nuôi cấy
cũ, thay mới bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung 5 – azacytidin 10 M, trong
Iso-propyl alcohol C3H7OH N¾p Ống nghiệm đựng tế bào Hốc đựng ống nghiệm ngâm trong dung dịch C3 H7OH
24 giờ. Sau thời gian ủ, rửa lại tế bào bám nhựa nuôi bằng PBS x 2 lần, thay mới môi trường nuôi cấy thường. Sau đó tiếp tục thay mới môi trường nuôi cấy như kỹ thuật nuôi cấy thông thường.
Quy trình biệt hóa của Shim và cs [114]
MSC được tiến hành biệt hóa theo hướng tạo tế bào cơ tim trong môi trường biệt hóa: 60% DMEM – LG/ 28 % MCDB – 201, 1.0 mg/ml insulin bò,
0.55 mg/ml transferin người, 0.5 l/ml sodium selenite, 50 mg/ml albumin huyết
thanh bò, 0.47 g/ml linoleic acid, 10-4 ascorbat phosphat, 10-9 dexamethason,
100 UI/ml penicillin, 100 l/ml streptomycin, 10 % FBS. Tiến hành thay môi
trường biệt hóa tương tự như kỹ thuật nuôi cấy thông thường.
2.3.3. Kỹ thuật đánh giá sự thành công của các quy trình đƣợc áp dụng
2.3.3.1. Các kỹ thuật nhận biết tế bào gốc trung mô sau phân lập, nuôi cấy từ tủy xương người
Nhuộm HE (Hematoxylin Eosin): Xác định nhân và bào tương tế bào nuôi cấy.
Nhuộm Hematoxylin làm cho nhân tế bào có màu xanh. Eosin nhuộm
nguyên sinh chất và mô liên kết, làm cho chúng có màu hồng hay đỏ. Kết quả được quan sát và chụp trên hệ thống KHV quang học.
Đo đƣờng kính ngang nhân tế bào: Xác định kích thước nhân tế bào nuôi cấy.
Sử dụng phần mềm Image Pro-Plus của KHV quang học Nikon eclipse E600 Nikon Digital Camera DXM 1200 để đo đường kính ngang của nhân tế bào, mỗi loại tế bào xác định thực hiện 30 lệnh đo.
Kỹ thuật chọn lựa tế bào bằng huỳnh quang FACS (Fluorescence ativated cell sorting): Xác định biểu hiện marker bề mặt CD34, CD45, CD13, CD73, CD90 trên tế bào nuôi cấy
* Nguyên lý: Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometer - FC) là kỹ thuật đếm và phân tích đồng thời các đặc tính vật lý của các phần tử riêng lẻ, thường là các tế bào, khi tế bào di chuyển trong một dòng dịch qua một chùm tia sáng đơn sắc
(tia laser). Phép phân tích này cho biết kích thước của tế bào, mức độ phức tạp của các hạt bên trong bào tương và các đặc tính phát huỳnh quang của chúng. Các đặc tính này được xác định bằng cách sử dụng hệ thống quang học - điện tử vì vậy cho biết các phần tử hoặc các tế bào tán xạ tia laser và phát huỳnh quang như thế nào.
Một thiết bị FC được cấu tạo bởi ba phần chính: Hệ thống tạo dòng chảy tế bào, hệ thống quang học và hệ thống điện tử.
Hình 2.3. Mô hình nguyên lý tạo dòng của thiết bị đếm tế bào dòng chảy Chùm tia sáng laser được chiếu vào dòng dịch được nén bằng động lực học. Nhiều detector được tập trung tại vị trí dòng tế bào đi qua chùm tia, bao gồm: một detector cùng hướng với chùm tia (Forward Scatter - FSC), các detector khác vuông góc với chùm tia (Side Scatter - SSC) cùng với một hoặc nhiều detector huỳnh quang. Từng tế bào dạng huyền phù có kích thước từ 0.2 ÷ 150
m xuyên qua chùm tia, tán xạ ánh sáng theo các hướng. Các chất phát huỳnh
quang trong tế bào hoặc được gắn với tế bào có thể được kích thích để phát xạ ánh sáng ở bước sóng dài hơn nguồn sáng. Sự tán xạ ánh sáng và phát xạ ánh sáng huỳnh quang của từng tế bào được thu nhận đồng thời bằng các detector nhờ sự phân tích sự thay đổi của độ sáng (brightness) (mỗi detetor cho một đỉnh
Hệ thống tạo dòng chảy tế bào Hệ thống quang học Chùm tia laser Chùm tia laser Buồng tạo dòng
phát xạ huỳnh quang). Các thay đổi này cung cấp nhiều thông tin về cấu trúc hóa học và vật lý của tế bào. FSC liên quan đến thể tích tế bào và SSC phụ thuộc vào tính phức tạp của phần tử (ví dụ: hình dạng của nhân, số lượng và loại các hạt trong bào tương hoặc sự thô ráp của màng tế bào). Một vài thiết bị FC trên thị trường không có detector huỳnh quang và chỉ có các detector tán xạ ánh sáng. Một vài thiết bị FC khác lại có khả năng phân lập tế bào sau khi đánh dấu huỳnh quang nhờ lắp thêm các bộ phận tích điện. FACS là kỹ thuật xác định đặc tính huỳnh quang của tế bào bằng thiết bị FC.
* Tiến hành:
-Tế bào nuôi cấy được tách khỏi bề mặt nhựa nuôi cấy bằng trypsin - EDTA 0,25 %.
- Bất hoạt enzym bằng môi trường nuôi cấy.
- Ly tâm lấy cặn tế bào 1200 vòng/ phút trong 10 phút. - Rửa lại bằng PBS x 2 lần.
- Ủ trong mỗi ống phân tích khoảng 500.000 tế bào với 100 l kháng thể
cần xác định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa lại tế bào sau ủ kháng thể bằng ly tâm trong dung dịch chuyên biệt.
Phân tích trên thiết bị FC500 Beckman Counter, sử dụng phần mềm chuyên
dụng để sử lý kết quả, so sánh với kết quả phân tích tế bào chứng âm - không ủ với kháng thể kháng đặc hiệu, dựa vào cường độ phát huỳnh quang.
* Đánh giá kết quả:
Cường độ phát huỳnh quang của mẫu phân tích bằng cường độ phát huỳnh quang của mẫu chứng âm: mẫu tế bào phân tích âm tính với kháng thể kháng kháng nguyên đích. Cường độ phát huỳnh quang của mẫu phân tích lớn hơn cường độ phát huỳnh quang của mẫu chứng âm: mẫu tế bào phân tích dương tính với kháng thể kháng kháng nguyên đích. Kết quả dương tính khi có trên 10% tế bào dương tính với kháng thể kháng đặc hiệu.
Biểu đồ 2.1. Cường độ tín hiệu huỳnh quang phân tích biểu hiện marker bề mặt của MSC bằng kỹ thuật FACS [103]. Các marker biểu hiện dương tính của MSC
bao gồm: CD49a, CD73, CD90, CD95, CD105; các marker biểu hiện âm tính: CD33, CD34, CD38, CD40, CD44, CD45, CD48, CD69, CD80, CD83, CD86.
Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào (Immunocytochemistry, ICC): Xác định biểu hiện CD34, CD45 trên bề mặt tế bào nuôi cấy
* Nguyên lý:
Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào – ICC, là phương pháp áp dụng nguyên lý phản ứng miễn dịch (phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể), để nghiên cứu protein tế bào. Dựa trên sự biểu hiện mang tính kháng nguyên trên bề mặt tế bào hay trong bào tương, các kháng thể đặc hiệu sẽ giúp cho việc nhận diện và
phân loại các tế bào trên các lát cắt hay tế bào được cố định trên cover slip.
Phương pháp sử dụng phức hợp streptavidin - biotin được hầu hết các phòng xét nghiệm hóa miễn dịch sử dụng trong nghiên cứu tế bào và mô. Với kỹ thuật này, ái lực cao của streptavidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đánh dấu peroxidase.
Hình 2.4. Mô hìnhkhuyếch đại tín hiệu phát hiện bằng phức hệ Enzym - Strepavidin - Biotin trong nhuộm hóa miễn dịch tế bào
* Vùi và đúc block paraffin:
Tạo khuôn để khi cắt không làm biến dạng tế bào và cấu trúc của chúng. Khuôn phổ biến nhất là paraffin có nhiệt độ nóng chảy phù hợp khoảng 56 -
580C. Ly tâm lấy cặn tế bào sau khi tách khỏi nhựa nuôi cấy bằng trypsin -
EDTA 0,25%. Cố định bằng paraformaldehyd 4%/PBS. Đúc paraphin theo các bước : + Ethanol 800 /1giờ. + Ethanol 950 x 3 lần x 1giờ/ 1lần. + Ethanol 1000 x 3 lần x 1giờ/ 1lần. + Xylen x 3 lần x 1giờ/1 lần. + Paraffin x 3 lần x 1giờ/1 lần.
+ Paraffin trong hút chân không/1 giờ. + Đúc block.
* Nhuộm tiêu bản hoá miễn dịch tế bào:
- Tiêu bản sau khi tẩy paraffin được nhúng vào nuớc cất 2 lần x 5 phút
- Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H O 3% x 5 phút
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS (Tris Buffer Saline) pH 7,6 x 5 phút - Khử các protein không đặc hiệu bằng BSA x 5 phút
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút, không để khô tiêu bản - Phủ kháng thể 1 của chuột kháng lại kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào của người trong 60 phút
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ kháng thể 2 có gắn biotin, kháng lại kháng thể 1 của chuột x 30 phút - Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ phức hợp Streptavidin – HRP (Horseradish Peroxidase) x 30 phút - Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ dung dịch DAB (Diamino Benzidine ) x 10 phút - Rửa nước chảy x 5 phút
- Nhuộm Hematoxyline 5 giây
- Khử nước, làm sạch tiêu bản, gắn lá kính rồi đọc kết quả trên KHV quang học.
Đọc kết quả dưới KHV quang học, các tế bào dương tính bắt màu vàng nâu ở chu vi tế bào.
* Đánh giá kết quả:
- Mức 0: hoàn toàn không bắt màu.
- Mức (+): dưới 10% tế bào bắt màu dương tính. - Mức (++): có trên 10% tế bào bắt màu dương tính.
Kết quả ở mức (++) mới được coi là dương tính. Sử dụng phần mềm Image